干扰素

干扰素是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力，抑制肿瘤细胞生长，清除早期恶变细胞等。干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，耐酸，具有多种生物活性，但对各种蛋白酶敏感，可被胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶破坏而失去活性。种属特异性很强，只有在同种细胞上才具有抗病毒作用。干扰素的沉降率低，不能透析，可通过滤菌器。具有广谱抗病毒作用，治疗乙型肝炎、丙型肝炎、疱疹、宫颈炎、红眼病、尖锐湿疣等。治疗毛细胞白血病。注射用于扰素可治疗多发性骨髓瘤、卡波济氏肉瘤、恶性黑色素瘤及喉乳头瘤。
不良反应：肌注可见发热、头痛、肌痛、少数人有疲乏无力、胃纳不佳；静注可出现高热、寒战、呕吐、肾损害、心率加快及血压不稳定。方法一、Cantell氏法
分离灰黄层 将血液400ml放入含有ACD抗凝剂的塑料袋，离心取血浆，吸取灰黄层13-15ml，放于冰箱4℃过夜。
血液[ACD抗凝剂]→血浆[吸取]→[4℃]灰黄层
氯化铵处理 灰黄层加30ml缓冲盐水溶液，再加9倍量冷的8.3g/L氯化铵液，混匀，4℃静置10min，离心(8000r/min) 20min，去溶血上清液，加入缓冲盐液，收集细胞沉淀，做成悬液。用氯化铵液重复处理一次，溶解残留红细胞。取沉淀的白细胞悬于培养液，置于冰浴。
灰黄层[缓冲盐液，氯化铵液]→[4℃离心 8000r/min]细胞沉淀[氯化铵]→白细胞悬液
诱生 将稀释的细胞悬液加白细胞干扰素，使其最后浓度达到100U/ml，37℃恒温水浴搅拌培养2h。诱生后的白细胞加入仙台病毒，使其最后浓度为100-150血凝U/ml。37℃搅拌过夜。
白细胞悬液[白细胞干扰素、仙台病毒]→[37℃]干扰素培养液
离心 次日将培养物于2500 r/min离心30 min，取上清液即得干扰素粗品，取样测定即可。
干扰素培养液[离心]→干扰素粗品
干扰素的初步精制 将干扰素粗品加入硫氰酸钾至0.5mol/L，用盐酸调pH 3.5，离心，弃上清液，将沉淀物加入94%冷乙醇，离心弃沉淀，上清液用盐酸调pH 5.5，离心弃沉淀，调pH 5.8，离心，分别处理上清液和沉淀。

沉淀I精制 将以上沉淀I加入pH2的甘氨酸-盐酸缓冲液(原体积1/50量)溶解，检测，得IIFN。
沉淀I[甘氨酸-盐酸缓冲液]→[pH2]IIFN
上清液II的处理 上清液II调pH为8，离心，弃上清液，沉淀加0.1 mol/L PB(原体积1/50量)、0.5 mol/L硫氰酸钾(pH为8)溶解，pH降至 5.5，离心，分别处理上清液和沉淀。

沉淀加0.1 mol/L PB(原体积1/2500量、pH 8)溶解，调pH为7-7.5，对PB(pH7.3)透析，次日离心，取上清液，检测，得PIFN-B。
沉淀[PB透析]→[pH7-7.5]上清液(PIFN-B)
上清液pH降至3，离心，沉淀加入0.1 mol/L PB(原体积1/5000量、pH8)溶解，调pH为7-7.5，对PB(pH 7.3)透析过夜，离心，取上清液，检测，得PIFN-A。
上清液[离心]→[pH3]沉淀[PB]→[pH7-7.5]上清液(PIFN-A)
方法二、童葵塘法
血细胞制备 取血液200ml，低速离心去上层血浆，保留白细胞和红细胞，加入肝素(1300 U/ml) 2ml 和培养液至原血量，加入卡那霉素至浓度为100 μg/ml。
血液[2ml肝素、卡那霉素]→血浆
起动诱生 将以上血浆，加适量干扰素，使最终浓度为100U/ml，37℃恒温水浴1h，每15min振摇1次。
血浆[干扰素]→[37℃]血细胞培养液
正式诱生 启动后的血细胞加入新城鸡瘟F系病毒，使其最后浓度为64-128血凝单位，37℃恒温水浴1h，每15min振摇1次，低速离心去上清液。加入肝素4ml、白蛋白培养液(0.2%)200 m1，并加入卡那霉素至浓度为100 μg/ml。置37℃旋转培养18-20h。
血细胞培养液[F系病毒]→[37℃]沉淀[肝素、白蛋白、卡那霉素]→[37℃]培养物
收获与酸处理 次日，将培养物离心(2000r/min)，吸取上清液，盐酸调pH 2，4℃放5天。再用氢氧化钠调pH 6-7，有咖啡色絮状沉淀生成，4℃放2-3天，沉淀分离取上清液，合并及除菌过滤，得粗制干扰素。
培养物[离心]→上清液[氢氧化钠]→[pH2, 4℃, pH6-7]干扰素粗品
干扰素的初步精制 将干扰素粗晶加入硫氰酸钾至0.5 mol/L，用盐酸调pH 3.5，离心，弃上清液，将沉淀物加入94%冷乙醇，离心弃沉淀，上清液用盐酸调pH 5.5，离心弃沉淀，调pH 5.8，离心，分别处理上清液和沉淀。

沉淀I精制 将以上沉淀I加入pH2的甘氨酸-盐酸缓冲液(原体积1/50量)溶解，检测，得IIFN。
沉淀I[甘氨酸-盐酸缓冲液]→[pH2]IIFN
上清液II的处理 上清液II调pH为8，离心，弃上清液，沉淀加0.1mol/L PB(原体积1/50量)、0.5 mol/L硫氰酸钾(pH为8)溶解，pH降至5.5，离心，分别处理上清液和沉淀。

沉淀加0.1 mol/L PB(原体积1/2500量、pH 8)溶解，调pH为7-7.5，对PB(pH 7.3)透析，次日离心，取上清液，检测，得PIFN-B。
沉淀[PB透析]→[pH为7-7.5]上清液(PIFN-B)
上清液pH降至3，离心，沉淀加入0.1 mol/L PB(原体积1/5000量、pH8) 溶解，调pH为7-7.5，对PB(pH 7.3)透析过夜，离心，取上清液，检测，得PIFN-A。
上清液[离心]→[pH3]沉淀[PB]→[pH7-7.5]上清液(PIFN-A)。