凝血酶

凝血酶，一种使纤维蛋白原水解成为纤维蛋白的蛋白酶，由308个氨基酸残基组成，且是双链分子，含有A链和B链，两链间由二硫键连接，其中，A链含49个氨基酸残基，又称轻链，B链由259个氨基酸残基组成，又称重链；本品存在于动物血液中，通常以无活性的酶原形式存在，能直接作用于凝血过程的最后环节，使纤维蛋白原变成纤维蛋白，加速血液凝固，起到快速止血的作用；能激活凝血因子Ⅷ，使可溶性纤维蛋白转变为难溶性纤维蛋白而形成凝血块，达到止血目的；可增强凝血因子Ⅷ和Ⅴ的活性，在钙和磷脂的参与下，促进凝血酶因子Xa，使凝血酶原转变为凝血酶；能促进血小板发生不可逆性的聚集和血小板释放反应，加速血液凝固；还可促进上皮细胞的有丝分裂，使创伤愈合时间缩短30%～50%；因此，常用于结扎止血困难的小血管、毛细血管以及实质性脏器出血的止血，也可用于外伤、手术、口腔科、耳鼻喉科、泌尿科、妇产科以及消化道等部位的出血。白色类白色的冻干块状或粉末，易溶于水，不溶于有机溶剂。由308个氨基酸残基组成的蛋白它是双链分子，含有A链和B链，两链间由二硫键连接。A链含49个氨基酸残基，又称轻链; B链由259个氨基酸残基组成，又称重链。A链氨基末端氨基酸是苏氨酸(Thr);而 B链氨基末端氨基酸是异亮氨酸 (Ile), 其最初的 4个氨基酸残基是异亮氨酸-颉氨酸-谷氨酸-甘氨酸(Ile-Val-Glu-Gly。凝血酶在体内以凝血酶原形式存在, 在凝血过程中, 凝血酶原复合物将其激活而转变为有丝氨酸蛋白类水解活性的凝血酶。 凝血酶的形成在凝血过程中起到了中心作用。 凝血酶形成后的作用至少包括以下5个方面：
(1)启动：一旦凝血酶形成后, 便可迅速启动以后阶段的止凝血过程, 包括作为促凝剂激活血小板、内皮细胞, 并激活因子 V、Ⅶ 、Ⅷ 。
(2)放大；凝血反应的放大是通过促凝酶复合物在内皮下基质和周围血细胞表面合成而实现的。 其中, 凝血反应的放大主要是通过 α-凝血酶的激活来完成, 同时, 凝血的放大反应相又可促使生成更多的 α-凝血酶, 并在血管受损伤处形成稳定的血栓, 从而终止血液丢失。
(3)血块形成的终止：血块形成的终止至少涉及两个连续的抑制过程和一个动力学抑制过程。 前者主要是蛋白酶抑制剂 AT-Ⅲ 系统和组织因子途径抑制物(TFPI)系统 。 而动力学抑制系统则是通过蛋白 C途径进行的。 在蛋白 C途径中, 首先是 APC的生成, 而 APC的形成则是通过 α-凝血酶与血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM)所形成的复合物, 即 α-凝血酶-TM使 PC变为 APC。通过这一动力学抑制系统可灭活凝血酶原酶和内源性凝血酶成分, 主要是辅因子蛋白如因子 Va和Ⅷ a的活性, 从而参与终止血块的形成。
(4)血块的清除：血块的清除是组织修复过程中的基本步骤, 同时要求纤溶酶的参与。 凝血酶对这一过程的调控是通过影响纤溶而间接对其产生影响的。 通过 TM-α-凝血酶复合物产生的 TAFIa可降低由 tPA及纤维蛋白激活谷氨酸纤溶酶原的速率, 保护纤维蛋白免受降解。 在 APC存在时, α-凝血酶的生存可显著减少, 同时降低 TAFIa的激活。
(5)修复：对损伤组织的修复是凝血过程的最后一步。 这一过程需要纤溶酶激活金属蛋白酶, 后者可使受损的细胞外基质降解, 并促使新生细胞迁移至受损伤部位。 在这一过程中, 凝血酶是一种强有力的生长因子和趋化吸引剂, 其对成纤维细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞有激活效应;α-凝血酶可激活血小板, 使血小板释放血管活性物和生长因子, 促进不同类型的细胞增殖和生长。

图1为凝血酶冻干粉1.粗凝血酶的分离
粗凝血酶的提取即去除血浆中的纤维蛋白原等杂蛋白, 同时保留凝血因子, 有利于凝血酶原的激活。 凝血酶原本身没有活性, 不能将纤维蛋白原转化为纤维蛋白, 只有将其激活成凝血酶后才能在凝血级联反应中发挥作用。
(1)凝血酶原的提取：凝血酶原的提取通常采用 3种方法:等电点沉淀法、柠檬酸钡吸附法和氢氧化镁吸附法。
等电点沉淀法根据蛋白质在溶液 pH为其等电点的条件下溶解度最低的原理, 用 1%的醋酸将适当稀释后的血浆 pH调至凝血酶的等电点 5.0～ 5.5之间, 静置分层后离心, 缓冲液溶解沉淀后即得粗凝血酶原溶液。
柠檬酸钡吸附法则根据柠檬酸钡能吸附依赖于维生素 K的凝血因子这一特性, 在柠檬酸钠抗凝获得的血浆中加入氯化钡产生柠檬酸钡, 凝血酶原等因子随之沉淀分离出来, 沉淀用EDTA解吸, 再离心去沉淀后获得粗凝血酶原溶液。
氢氧化镁吸附法由 Seeger首次报道, 以等电点沉淀法为基础, 沉淀用氢氧化镁吸附溶解的沉淀物, 以二氧化碳洗脱凝血酶原, 再加硫酸铵至 65%饱和度沉淀凝血酶原。
以上 3种方法相比, 等电点沉淀法操作较简便, 应用较多,但得到的粗凝血酶活性不高;后两种方法得到的粗凝血酶活性较前者有所提高, 但操作比较繁琐。
(2)凝血酶原激活：生理条件下 , 凝血酶由凝血酶原在凝血因子Ⅹa、凝血因子 V、Ca2+和磷脂作用下激活生成。 在缺乏某些激活因子的情况下, 也能将凝血酶原转化为凝血酶, 但是转化率很低。 在从血浆中提取凝血酶的过程中, 凝血酶原的激活是关键的一步。采用单独的Ca2+激活, 即在粗凝血酶原溶液中加入一定浓度的 CaCl2溶液, 室温下放置 1.5～2 h, 凝血酶活性达到最高, 残留的纤维蛋白原转化为纤维蛋白后析出 , 过滤后即得活化的粗凝血酶溶液。
2.粗凝血酶的纯化
纯化的方法有很多种, 传统的物理化学方法即丙酮沉淀法和硫酸铵分级盐析法, 这两种方法操作简便, 成本低, 但得到的凝血酶制品纯度不高, 回收率低, 应用上受到一定限制。 与传统的物理化学方法相比, 采用层析法分离血浆蛋白具有高特异性、高选择性的优点, 能够用于血浆中一些微量物质的分离, 以获得高纯度的适合临床需要的血浆制品 , 并且与沉淀法相比更易于自动化;同时, 层析法纯化过程中还能起到去除血浆制品中的病原体的作用, 从而提高血液制品临床使用的安全性。目前纯化凝血酶的层析法主要采用凝胶过滤层析、离子交换层析和肝素亲和层析三种方法。
(1)凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是应用凝胶过滤介质分离不同大小的物质的一种技术, 可用于相对分子质量从几百到10︿6数量级的物质的分离纯化。 该技术常用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。 凝血酶的分子质量为 36 ku, 选择适的过滤介质就能有效的去除其他杂蛋白。
(2)离子交换层析：离子交换层析是利用蛋白质所带离子或表面电荷的区别, 将目标蛋白吸附到 DEAE、CM等离子交换柱上而达到去除杂蛋白的目的的一种方法。 离子交换层析在治疗用血浆蛋白制品的制备中得到广泛的应用。 在 pH﹥ 5.5的条件下, 凝血酶分子带负电荷, 因此可用阴离子交换柱对其进行纯化。
(3)肝素亲和层析：亲和层析是应用耦联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物, 使目标产物得到分离纯化的液相层析法。 凝血酶与低分子质量肝素之间有特异性的作用。 利用它们之间的特异性亲和作用, 可以将低分子质量肝素固定载体上, 对凝血酶进行亲和层析纯化。1.本品遇酸、碱、重金属发生反应而降效。
2.为提高上消化道出血的止血效果，宜先服一定量制酸剂中和胃酸后口服本品，或同时静脉给予抑酸剂。
3.本品还可用磷酸盐缓冲液(pH7.6)或冷牛奶溶解。如用阿拉伯胶、明胶、果糖胶、蜂蜜等配制成乳胶状溶液，可提高凝血酶的止血效果，并可适当减少本品用量。
有关凝血酶的概述、理化性质、药理作用、临床应用、注意事项等是由Chemicalbook的丁红编辑整理。（2015-11-16）1.对于发生急性消化道出血的患者可口服凝血酶使出血部位迅速止血。
2.对难治性产后出血可采用液体喷洒或纱布按压的方式给予凝血酶止血治疗。
3.在泌尿外科中可通过导尿管灌注凝血酶溶液和抗生素来治疗出血性膀胱炎, 可同时达到止血和促进受损上皮组织再生修复的作用。
4.在以往使医生感到头痛的耳鼻喉科疾病及相关手术出血的处理上, 采用直接灌注凝血酶或用凝血酶液浸湿的明胶海绵敷贴出血处, 可得到满意的止血效果, 减轻病人痛苦。
5.不仅在脑出血、脑缺血中有毒性作用, 在中枢神经系统正常发育和损伤保护中也有重要作用。口服或灌注：用于消化道出血，将本品用温开水或生理盐水(不超过37℃)溶解成10～100U/ml的溶液，每次 1000～4000U，也可根据出血部位及程度适当增减浓度、次数。
局部用药：①一般剂量为将本品用灭菌生理盐水溶解成 50～200U/ml的溶液，喷雾创面。 ②大量出血时，可使用明胺海绵纱条或氧化纤维素蘸取本品溶液贴于创面或将干粉喷洒于创面。③整形外科、拔牙、皮肤移植、肝素化患者穿刺部位渗血，常用本品100U/ml溶液止血。 ④肝脾破裂大出血止血采用凝血酶溶液1000～2000U/ml。1.偶可致过敏反应，应立即停药，并进行抗过敏治疗。
2.凝血酶误入血管可致血管内凝血（血栓形成）而危及生命。
3.外科止血中应用凝血酶曾有致低热反应的报道。1.本品必须直接与创面接触，才能起止血作用；应新鲜配制使用。
2.严禁作血管内、肌内或皮下注射，以防引起局部坏死甚至形成血栓而危及生命。
3.加温，酸、碱或重金属盐类可使其活力下降而失去作用。
4.如出现过敏反应症状时应停药。
5.妊娠期仅在具有明显指征下，病情必要时才能使用。凝血酶为牛血或猪血中提取的凝血酶原，经激活而得凝血酶的无菌冻干品，为白色或类白色的冻干块状物或粉末。干粉在2～8⁰C储存很稳定，干粉易溶于水，0.9％的氯化钠溶液显浑浊，不溶于有机溶剂。在室温水溶液8h内失活。故须临用时新鲜配制，遇热、称酸、碱、金属等活力降低。凝血酶为局部止血药，局部应用无副作用。使用时必须直接与创面接触，才能起到止血作用。但是本品严禁注射，不得与酸、碱及重金属配伍。动物试验有机抗原体反就、过敏反应。如出理此症状，应立即停药。
局部止血用氯化钠注射液溶解成含50～250单位/ml的溶液或干粉，喷雾或洒于创伤表面。消化道止血，用温开水（≤37⁰)溶解成10～100单位/ml的溶液，品服或局部灌注，根据出血部位及程度适当增减浓度、次数。局部止血药，用于局部出血及消化道出血生化研究原料处理、沉淀取猪血液2kg，加入枸橼酸钠（38g/L即3.8%)溶液200ml抗凝，混匀，离习分离，取出上清液血浆，在血浆加入10倍于血浆量的蒸馏水稀释，用300ml乙酸（1％）调节Ph为5.3，待沉淀完全，于离心机中离心5～10min，弃去离心液，收集沉淀，得凝血酶原。
动物血液^枸橼酸钠→_原料处理血浆^{蒸馏水：HAc;Ph5.3}→_沉淀凝血酶原
分离、沉淀、洗涤取凝血酶原，在25～ 30C⁰下，加入氯化钠（0.9%)的溶液700ml,使之溶解，再在每升溶液中加入15g氯化钙，充分搅拌10min，使之溶解，冷室置1h，离心分离，取上清液加等量冷冻丙酮，搅拌均匀后，静置过夜。离心分离，沉淀再加冷冻丙酮研细，冷室放置2～ 3d,过滤，得沉淀后用乙醚洗涤，真空干燥，即得粗制凝血酶，约10g。
凝血酶原^{NaCl;CaCl₂;丙酮}→_{分离；沉淀}沉淀^乙醚→_洗涤粗制凝血酶
除杂质、沉淀、干燥在粗制凝血酶中加入200ml氯化钠液（9g/L），使之溶解，溶解后0⁰C放置6h，过滤，取沉淀再加150ml氯化钠液（9g/L）重复以上操作1次，合并两次滤液。用乙酸（1%)调节Ph至5.5。离心分离，沉淀弃去，取上清液加入2倍于上清液量的冰冻丙酮，静置2h，待沉淀完全，离心分离，沉淀用冷冻丙酮研细，放置24h，滤去溶液。沉淀分别用无水乙醇、乙醚洗涤，真空干燥，即得精致凝血酶，约0.4g。粗制凝血酶^{NaCl;HAc;^0<0}C;pH5.5→滤液^丙酮→_沉淀干燥精制成品