甜叶菊提取物
甜叶菊提取物 性质
甜叶菊提取物以菊科植物甜菊Stervia rebaudiana.的叶子为原料提取的物质，主要活性成分为甜苷，甜菊糖苷作甜味剂，具有降血糖、降血压、促进新陈代谢、治疗胃酸过多的作用。
甜叶菊原产于南美的巴拉圭和巴西，早在400多年前就被巴拉圭居民用来制作甜茶。1905 年由植物学家Bertoni命名为Stevia rebaudiana而一直沿用至今。1955年开始人工苗圃栽培试验，1964年巴拉圭Enrigue de Gasperi从事甜叶菊大田移植驯化获得成功。20世纪60年代末，这种植物受到许多国家和地区的重视。日本、新加坡、马来西亚、韩国、以色列及中国均有大量种植。日本自1969年禁用甜蜜素以来，对甜菊苷倍加重视。但由于其人体毒理学和代谢资料尚不够完整，目前世界上仅中国、日本、韩国、巴西、巴拉圭、泰国和马来西亚等8个国家批准使用，甜菊苷的ADI值为5.5mg/kg。截止2000 年，尚未得到欧美等国家的批准。在过去10年内，FDA共3次拒绝批准它的食品添加剂地位。但是，1995年9月18日，FDA却又批准它可以作为 “膳食补充剂” (Dietary Supplement) 进行销售和消费。
图1为甜叶菊其甜味成分主要为甜菊糖苷(stevioside)、甜菊醇双糖苷(steviolbioside)、莱包迪苷A (rebaudioside A) (R-A)、莱包迪苷B (rebaudioside B) (R-B)、莱包迪苷C(rebaudioside C) (R-C)、莱包迪苷D(rebaudioside D) (R-D)、莱包迪苷E(rebaudiosideE) (R-E)、杜尔可苷A (dulcoside A) (Dul-A)。
甜叶菊苷：白色至浅黄色结晶性粉末。有清凉的甜味，较之蔗糖甜约 300倍。高浓度者稍带苦味。相对分子质量 804.87。熔点196～198℃。比旋光度-39.3° (c=5.7，H2O)。化学性质稳定、耐高温。其甜味可久留口中。在空气中吸湿，微溶于乙醇，溶于水，在食品中受热不变色。分子量大，渗透性差。无毒。本信息是由Chemicalbook的蒋石编辑整理。甜菊糖苷作甜味剂，具有降血糖、降血压、促进新陈代谢、治疗胃酸过多的作用。
图2为连续水提取法
图3为大孔吸附树脂法
虽然甜菊A苷与其他双萜苷一样可从甜菊叶子中提取，但更吸引人的方法是通过酶法水解甜菊苷成Rubusoside，然后再通过一系列化学反应转化成甜菊A苷。
1.从甜菊叶子中提取甜菊A苷
在过去的20多年中，人们努力尝试从甜菊叶子中提取精制出甜菊A苷，并希望能够实现工业化生产。已知的提取工艺是高度极性的水，这是因为甜菊苷仅微溶于水而A 苷在水中的溶解度很大。通过浓缩脱水，再用甲醇提取即可优先分离出A苷产品，但其中还含有部分甜菊苷。去除甲醇后，借助二氧化硅胶柱以丙醇-水-乙酸盐溶液作流动相进行色谱分离，再在戊醇水溶液中进行重结晶可以得到纯净的甜菊A苷。通过这种方法，可从叶子中提取出约0.25%的结晶A苷。而不经色谱分离，就可从干叶中提取出6.5%的甜菊苷。显然，提取法没有经济效益，因此有很多人都在致力于通过化学途径转化甜菊苷成甜菊A苷的研究。
2.甜菊苷向甜菊A苷的转化
1977年，日本田中等人成功地通过酶水解，将甜菊苷转化成另一种天然双萜苷Rebusoside (我国华南地区蔷薇科植物Rubus suavissimus的叶子中含有这种糖苷)，然后再通过三个步骤即可转化成甜菊A苷，得率75%。这一过程的关键在于，通过从微生物Aspergillus oryzae提取出的酶，对甜菊苷分子β-槐糖基与终端糖基醚交联部分进行的选择性水解。
3.通过水解实现各种甜菊双糖苷之间的相互转化
加碱皂化甜菊苷和甜菊E苷可生成相同的甜菊醇糖苷，这过程使用含10% NaOH 或KOH的水溶液，经过1h的回流反应即可完成。如果使用含有KOH的甲醇-水溶液，则可以提高甜菊醇糖苷的得率。还有人通过皂化方法转化甜菊D苷成B苷，而A苷则可通过水解酶转化作用转化成B苷。
图4为各种甜菊醇糖苷的水解转化如果用上述方法提取出来的甜菊苷产品风味不太理想，那很可能是由于没有完全去除掉甜味杂质，或是提取产品中的甜菊苷与甜菊A苷的比例不合适。这时，可以使用复配、酶改性或化学改性等方法进行改良。
用来改善提取产物风味的酶处理法，除了通过酶重组法转变甜菊苷成味觉特性更好的甜菊A苷外，还可以使用适当的糖基转移酶将蔗糖分子中的Glc或Fru单元转移至甜菊苷或其他类似物分子上。例如，利用β-果糖基转移酶 (β-呋喃果糖苷酶) 在甜菊苷分子旁接上1mol的Fru，转变成果糖基甜菊苷 (Fructosyl Stevia)，其甜味特性得以改良，向蔗糖的甜味靠近。利用α-葡糖基转移酶，在甜菊苷分子旁接上1mol的Glc，转变成α-葡糖基甜菊苷 (Glucosyl Stevia)，可使甜味特性改良，甜度100～200倍，替代蔗糖的比例由原来的20%～25%，提高到50%～60%。图5示出经过葡糖基转移酶处理前后甜叶菊提取物的成分变化情况。
图5为葡糖基转移酶处理前后甜叶菊提取物甜味成分的变化甜叶菊苷产生热量少，故适于糖尿病患者作甜味剂，并可用作甜味改性或强化剂，配红白糖、果糖、麦芽糖、糖精等，以改进甜味。据 GB2760—1996，可用于液体和固体饮料及糖果、糕点。此外，本品尚有降低血压、促进新陈代谢作用。20世纪70年代，日本、韩国、巴西和美国等都进行过这方面的研究，结果表明这种天然提取物是安全的。巴拉圭使用甜叶菊及提取物已有好几个世纪了，在巴西其食用历史也很长，在日本也食用了近50年了，这些事实都证实了甜菊苷的食用安全性。
20世纪70年代日本进行了大量的研究，以分析甜菊苷是否具有致突变性和致癌性。日本厚生省对11个食用甜菊苷地区的癌症调查中，没发现任何值得注意的事例。 1985年，日本山田等人报道对雄、雌小鼠38种器官的组织病理学分析结果，没发现任何有与甜菊苷摄入量有关的毒性效果。
虽然已进行的大量研究，包括长达2年的慢性毒理学研究均未发现甜菊苷有任何致突变的可能，但有人发现具有代谢活性的甜菊醇是会产生突变效果的。1985年Pezzuto 等人使用经Aroclor1254或苯巴比妥及辅酶Ⅱ处理的小鼠匀浆肝脏组织中的S-9部位作为活性系统，使用Salmonella typhimurium TM677携带 “R-因子” 质粒PKM1001作为标志系统进行诱变试验。他们总结认为，细胞色素P-450传递的代谢活性与甜菊醇 C-16和C-17之间的一个双键有关，它能产生至今尚未被人们认识的诱变因子; 还认为甜菊醇C-13位羟基是诱变的表现式，而甜菊醇C-13位的乙酰化衍生物会阻止其诱变活性。他们还发现有代谢活性的甜菊醇，在能观察到有诱变活性的浓度范围内，具有很强的杀菌活性。
由于甜菊醇是在小鼠体内产生的，小鼠的微生物群系与人体的有区别，且试验所用的甜菊苷浓度至少是正常食品中可能使用量的100倍以上。在消化道内浓度的稀释，必然极大地减少发生突变的可能。因此，对这个试验结果不必太紧张。
含有50%甜菊苷和40%甜菊双糖苷的甜叶菊提取物，对大鼠的半数致死量LD50为 3.4g/kg，对小鼠的半数致死量为17～42g/kg。Medon用甜菊A、B、C苷，甜菊醇双苷和卫茅A苷口服喂养小鼠，均发现无毒。Akashi等人用含A苷和甜菊苷的甜叶菊提取液喂养小鼠3个月进行亚急性毒理试验，也没有发现任何有害作用。
1985年，山田等人用含有甜菊A苷及甜菊苷的甜叶菊提取物喂养大鼠22个月，结果表明提取物对大鼠的最大无作用量是550mg/kg。另一个2年的喂养试验表明，甜叶菊提取物没有慢性毒性和致癌性。R. E. Wingard等人的活体外试验表明，大鼠肠道微生物能将甜菊A苷降解成甜菊醇，转化率大约为65%，而相同条件下甜菊苷则几乎全部转化成甜菊醇。
甜叶菊提取物的最大问题，目前仍在于甜味不正，带有明显的苦涩味，甜味刺激缓慢，味觉延绵。一般的甜菊糖只有90%～92%的纯度，由于成分的不确定性，导致难以良好规范生产。因此，尽管号称为 “天然甜味剂”，但一直未能得到欧美等国家的认可，目前世界上仅8个国家批准使用。美国2000年报道的研究资料表明，它有可能导致突变及繁殖方面的问题，如使雄鼠排精量减少，雌鼠产仔量减少，幼鼠个体变小等。截止2000年，过去10年内FDA已3次拒绝批准它的食品添加剂地位。因此，甜叶菊提取物虽然在我国、日本、韩国有一定的市场，但前景并不太乐观。不过，美国FDA 却又于1995年9月18日批准它可以作为膳食补充剂加以使用。
甜叶菊原产于南美的巴拉圭和巴西，早在400多年前就被巴拉圭居民用来制作甜茶。1905 年由植物学家Bertoni命名为Stevia rebaudiana而一直沿用至今。1955年开始人工苗圃栽培试验，1964年巴拉圭Enrigue de Gasperi从事甜叶菊大田移植驯化获得成功。20世纪60年代末，这种植物受到许多国家和地区的重视。日本、新加坡、马来西亚、韩国、以色列及中国均有大量种植。日本自1969年禁用甜蜜素以来，对甜菊苷倍加重视。但由于其人体毒理学和代谢资料尚不够完整，目前世界上仅中国、日本、韩国、巴西、巴拉圭、泰国和马来西亚等8个国家批准使用，甜菊苷的ADI值为5.5mg/kg。截止2000 年，尚未得到欧美等国家的批准。在过去10年内，FDA共3次拒绝批准它的食品添加剂地位。但是，1995年9月18日，FDA却又批准它可以作为 “膳食补充剂” (Dietary Supplement) 进行销售和消费。
图1为甜叶菊其甜味成分主要为甜菊糖苷(stevioside)、甜菊醇双糖苷(steviolbioside)、莱包迪苷A (rebaudioside A) (R-A)、莱包迪苷B (rebaudioside B) (R-B)、莱包迪苷C(rebaudioside C) (R-C)、莱包迪苷D(rebaudioside D) (R-D)、莱包迪苷E(rebaudiosideE) (R-E)、杜尔可苷A (dulcoside A) (Dul-A)。
甜叶菊苷：白色至浅黄色结晶性粉末。有清凉的甜味，较之蔗糖甜约 300倍。高浓度者稍带苦味。相对分子质量 804.87。熔点196～198℃。比旋光度-39.3° (c=5.7，H2O)。化学性质稳定、耐高温。其甜味可久留口中。在空气中吸湿，微溶于乙醇，溶于水，在食品中受热不变色。分子量大，渗透性差。无毒。本信息是由Chemicalbook的蒋石编辑整理。甜菊糖苷作甜味剂，具有降血糖、降血压、促进新陈代谢、治疗胃酸过多的作用。
图2为连续水提取法
图3为大孔吸附树脂法
虽然甜菊A苷与其他双萜苷一样可从甜菊叶子中提取，但更吸引人的方法是通过酶法水解甜菊苷成Rubusoside，然后再通过一系列化学反应转化成甜菊A苷。
1.从甜菊叶子中提取甜菊A苷
在过去的20多年中，人们努力尝试从甜菊叶子中提取精制出甜菊A苷，并希望能够实现工业化生产。已知的提取工艺是高度极性的水，这是因为甜菊苷仅微溶于水而A 苷在水中的溶解度很大。通过浓缩脱水，再用甲醇提取即可优先分离出A苷产品，但其中还含有部分甜菊苷。去除甲醇后，借助二氧化硅胶柱以丙醇-水-乙酸盐溶液作流动相进行色谱分离，再在戊醇水溶液中进行重结晶可以得到纯净的甜菊A苷。通过这种方法，可从叶子中提取出约0.25%的结晶A苷。而不经色谱分离，就可从干叶中提取出6.5%的甜菊苷。显然，提取法没有经济效益，因此有很多人都在致力于通过化学途径转化甜菊苷成甜菊A苷的研究。
2.甜菊苷向甜菊A苷的转化
1977年，日本田中等人成功地通过酶水解，将甜菊苷转化成另一种天然双萜苷Rebusoside (我国华南地区蔷薇科植物Rubus suavissimus的叶子中含有这种糖苷)，然后再通过三个步骤即可转化成甜菊A苷，得率75%。这一过程的关键在于，通过从微生物Aspergillus oryzae提取出的酶，对甜菊苷分子β-槐糖基与终端糖基醚交联部分进行的选择性水解。
3.通过水解实现各种甜菊双糖苷之间的相互转化
加碱皂化甜菊苷和甜菊E苷可生成相同的甜菊醇糖苷，这过程使用含10% NaOH 或KOH的水溶液，经过1h的回流反应即可完成。如果使用含有KOH的甲醇-水溶液，则可以提高甜菊醇糖苷的得率。还有人通过皂化方法转化甜菊D苷成B苷，而A苷则可通过水解酶转化作用转化成B苷。
图4为各种甜菊醇糖苷的水解转化如果用上述方法提取出来的甜菊苷产品风味不太理想，那很可能是由于没有完全去除掉甜味杂质，或是提取产品中的甜菊苷与甜菊A苷的比例不合适。这时，可以使用复配、酶改性或化学改性等方法进行改良。
用来改善提取产物风味的酶处理法，除了通过酶重组法转变甜菊苷成味觉特性更好的甜菊A苷外，还可以使用适当的糖基转移酶将蔗糖分子中的Glc或Fru单元转移至甜菊苷或其他类似物分子上。例如，利用β-果糖基转移酶 (β-呋喃果糖苷酶) 在甜菊苷分子旁接上1mol的Fru，转变成果糖基甜菊苷 (Fructosyl Stevia)，其甜味特性得以改良，向蔗糖的甜味靠近。利用α-葡糖基转移酶，在甜菊苷分子旁接上1mol的Glc，转变成α-葡糖基甜菊苷 (Glucosyl Stevia)，可使甜味特性改良，甜度100～200倍，替代蔗糖的比例由原来的20%～25%，提高到50%～60%。图5示出经过葡糖基转移酶处理前后甜叶菊提取物的成分变化情况。
图5为葡糖基转移酶处理前后甜叶菊提取物甜味成分的变化甜叶菊苷产生热量少，故适于糖尿病患者作甜味剂，并可用作甜味改性或强化剂，配红白糖、果糖、麦芽糖、糖精等，以改进甜味。据 GB2760—1996，可用于液体和固体饮料及糖果、糕点。此外，本品尚有降低血压、促进新陈代谢作用。20世纪70年代，日本、韩国、巴西和美国等都进行过这方面的研究，结果表明这种天然提取物是安全的。巴拉圭使用甜叶菊及提取物已有好几个世纪了，在巴西其食用历史也很长，在日本也食用了近50年了，这些事实都证实了甜菊苷的食用安全性。
20世纪70年代日本进行了大量的研究，以分析甜菊苷是否具有致突变性和致癌性。日本厚生省对11个食用甜菊苷地区的癌症调查中，没发现任何值得注意的事例。 1985年，日本山田等人报道对雄、雌小鼠38种器官的组织病理学分析结果，没发现任何有与甜菊苷摄入量有关的毒性效果。
虽然已进行的大量研究，包括长达2年的慢性毒理学研究均未发现甜菊苷有任何致突变的可能，但有人发现具有代谢活性的甜菊醇是会产生突变效果的。1985年Pezzuto 等人使用经Aroclor1254或苯巴比妥及辅酶Ⅱ处理的小鼠匀浆肝脏组织中的S-9部位作为活性系统，使用Salmonella typhimurium TM677携带 “R-因子” 质粒PKM1001作为标志系统进行诱变试验。他们总结认为，细胞色素P-450传递的代谢活性与甜菊醇 C-16和C-17之间的一个双键有关，它能产生至今尚未被人们认识的诱变因子; 还认为甜菊醇C-13位羟基是诱变的表现式，而甜菊醇C-13位的乙酰化衍生物会阻止其诱变活性。他们还发现有代谢活性的甜菊醇，在能观察到有诱变活性的浓度范围内，具有很强的杀菌活性。
由于甜菊醇是在小鼠体内产生的，小鼠的微生物群系与人体的有区别，且试验所用的甜菊苷浓度至少是正常食品中可能使用量的100倍以上。在消化道内浓度的稀释，必然极大地减少发生突变的可能。因此，对这个试验结果不必太紧张。
含有50%甜菊苷和40%甜菊双糖苷的甜叶菊提取物，对大鼠的半数致死量LD50为 3.4g/kg，对小鼠的半数致死量为17～42g/kg。Medon用甜菊A、B、C苷，甜菊醇双苷和卫茅A苷口服喂养小鼠，均发现无毒。Akashi等人用含A苷和甜菊苷的甜叶菊提取液喂养小鼠3个月进行亚急性毒理试验，也没有发现任何有害作用。
1985年，山田等人用含有甜菊A苷及甜菊苷的甜叶菊提取物喂养大鼠22个月，结果表明提取物对大鼠的最大无作用量是550mg/kg。另一个2年的喂养试验表明，甜叶菊提取物没有慢性毒性和致癌性。R. E. Wingard等人的活体外试验表明，大鼠肠道微生物能将甜菊A苷降解成甜菊醇，转化率大约为65%，而相同条件下甜菊苷则几乎全部转化成甜菊醇。
甜叶菊提取物的最大问题，目前仍在于甜味不正，带有明显的苦涩味，甜味刺激缓慢，味觉延绵。一般的甜菊糖只有90%～92%的纯度，由于成分的不确定性，导致难以良好规范生产。因此，尽管号称为 “天然甜味剂”，但一直未能得到欧美等国家的认可，目前世界上仅8个国家批准使用。美国2000年报道的研究资料表明，它有可能导致突变及繁殖方面的问题，如使雄鼠排精量减少，雌鼠产仔量减少，幼鼠个体变小等。截止2000年，过去10年内FDA已3次拒绝批准它的食品添加剂地位。因此，甜叶菊提取物虽然在我国、日本、韩国有一定的市场，但前景并不太乐观。不过，美国FDA 却又于1995年9月18日批准它可以作为膳食补充剂加以使用。