赖氨酸(lysine,Lys)含量测定试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
注 意 : 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
赖氨酸是人体必需氨基酸之一,能促进人体发育、增强免疫功能,并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低,且在加工过程中易被破坏而缺乏,故称为限制性氨基酸。
赖氨酸(lysine,Lys)含量测定试剂盒测定原理:
蛋白质中的赖氨酸具有一个游离的ε-NH2,它与茚三酮试剂反应生成蓝紫色物质,其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸的含量成线性关系。亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同,而且仅有—个游离氨基(ε-NH2),所以通常用亮氨酸配制标准液。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水、水浴锅。
试剂的组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入12.5mL试剂三充分溶解混匀;
试剂二:液体12.5mL×1瓶,4℃保存;
试剂三:液体15mL×1瓶,4℃保存;
试剂四:60%乙醇,自备。
赖氨酸提取:
样本烘干粉碎,称取约0.01g样本,加入1mL提取液,充分匀浆。80℃水浴提取20min,冷却后10000g离心10min,取上清待测。
赖氨酸(lysine,Lys)含量测定试剂盒测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至570nm,蒸馏水调零。
2、 工作液的配制:取10mL试剂一与10mL试剂二混合摇匀,取上清备用。用不完的试剂4℃保存。
3、 在有盖EP管中加入下列试剂:
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 |
样本 | 200 |
|
提取液 |
| 200 |
工作液 | 400 | 400 |
混匀,80℃水浴30min(盖紧,以防止水分散失),冷却至常温。
混匀,取1000μL至1mL玻璃比色皿中,于530nm波长处记录吸光值A。△A=A测定管-A空白管。空白管只要做一管。
赖氨酸(lysine,Lys)含量测定试剂盒赖氨酸含量计算:
标准条件下测定回归方程为y = 0.0062x - 0.0212;x为赖氨酸含量(µg/mL),y为吸光值。
1. 按照蛋白浓度计算
赖氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(Cpr ×V1)×1.1515
=185.73×(△A+0.0212) ÷Cpr
2.按照样本质量计算
赖氨酸含量(µg/g干重)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(W ×V1÷V2)×1.1515
=185.73×(△A+0.0212) ÷W
V1:加入反应体系中样本体积,0.2mL;V2:加入提取液体积,1 mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;1.1515,校正系数。
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