辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒

辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书

分光光度法50 管/24 样

注   意 ：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒测定意义：

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的 NADH 经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧， 在合成 ATP 的同时，形成大量的 ROS，同时NADH 再生为 NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。  

测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原

氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值；而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用 MTT 还原法检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒试剂的组成和配制：

酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 15 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 4 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20 ℃保存，用时加入 4mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周；

试剂四：粉剂×1 瓶，4 ℃保存，用时加入 4mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周；

试剂五：液体 1.8mL×1 支，4 ℃保存；

试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

NAD+和 NADH 的提取：

1血清（浆）中 NAD+和 NADH 的提取

NAD+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10  的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2组织中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g组织，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4  ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADH 的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g组织，加入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和， 混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：酸性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min

（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。NADH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104  个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min

（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4  ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒测定步骤：

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。

2、 加样表(在 1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加样）：

充分混匀，静置 5min 后，20000g，25℃离心 5min，弃上清，沉淀中加入：

混匀，570nm 下比色，读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值A2，计算△A=A2-A1。

注意事项：

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若 NAD+测定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH 测定中△A（A2-A1）≤0.0222，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间 20min 延长到 60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。

5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 50 管保证测 24 个NAD+或 NADH.。

NAD+和 NADH 含量的计算：

（一） NAD+含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 0.295x + 0.0302，R2 = 0.9978；其中 y 为△A，x 为 NAD+浓度nmol/mL

1、血清（浆）中NAD+含量计算

NAD+含量(nmol/mL）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=67.8×( △A -0.0302）

2、组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算(1)按样本蛋白浓度计算

NAD+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(V1×Cpr)= 3.4×(△A -0.0302）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NAD+ (nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(W×V1÷V2)= 6.8×( △A -0.0302）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NAD+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.014×( △A -0.0302）

（二）NADH 含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 0.2808x + 0.0222，R2 = 0.9976；其中 y 为△A，x 为 NADH 浓度 nmol/mL

1、血清（浆）中NADH 含量计算

NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 71.2×( △A -0.0222）

2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V1×Cpr)= 3.6×( △A -0.0222）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 7.1×( △A -0.0222）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADH (nmol/104 cell）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.014×(△A -0.0222）

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆） 体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数， 500 万。

注意：

最低检测限为 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot