乙酸激酶(acetate kinase,ACK)试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
乙酸激酶(acetate kinase,ACK)试剂盒测定意义:
ACK主要存在于微生物中,催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP,是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶,尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。
测定原理:
(1)ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP,(2)丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸,(3)乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+,(4)在340nm下测定NADH氧化生成NAD+速率,即可反映ACK活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体60mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×2瓶,-20℃保存;
试剂三:液体1.2mL×1支,4℃保存;
样本的前处理:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
乙酸激酶(acetate kinase,ACK)试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)工作液的配置:临用前取试剂二一瓶,加入25mL试剂一和500μL试剂三,充分混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;现配现用;
(2)在1mL石英比色皿中加入100μL样本和900μL工作液,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 3min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
ACK活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ACK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ACK(nmol/min /g 鲜重)= [ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=536×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ACK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.072×ΔA
V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,3 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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