β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,β-1,3-GA)试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,β-1,3-GA)试剂盒测定意义:
β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中,催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。在植物染病或处于其他逆境条件下,可诱导细胞大量合成β-1,3-GA,因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。
测定原理:
β-1,3-GA水解昆布多糖,内切β-1,3-葡萄糖苷键,产生还原末端,通过测定还原糖生成速率来计算其酶活性。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入3mL蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂4℃保存;
试剂二:液体30mL×1瓶,4℃保存;
粗酶液提取:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,β-1,3-GA)试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至550nm,蒸馏水调零。
2、样本测定(在1.5mL EP管中依次加入下列试剂):
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 100 | 100 |
蒸馏水 |
| 100 |
试剂一 | 100 |
|
充分混匀,放入37℃水浴60 min
充分混匀,95℃水浴5min(盖紧,防止水分散失),流水冷却,550nm处记录各管吸光值A,如果吸光值大于2,可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式乘以相应稀释倍数),ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
β-1,3-GA活性计算:
1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0958x -0.0192;x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。
2、血清(浆)β-1,3-GA活力的计算
β-1,3-GA(mg/h/mL)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷V1=10.438×(ΔA +0.0192)
3、细胞、细菌和组织中β-1,3-GA活力的计算
(1) 按蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h/mg prot)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(V1×Cpr)=10.438×(ΔA +0.0192) ÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h /g 鲜重)=[( ΔA +0.0192)÷0.09585×V1]÷(W×V1÷V2)=10.438×(ΔA +0.0192) ÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h /104 cell)= [( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0208×(ΔA+0.0192)
V1:加入反应体系中样本体积,0.1mL;V2:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500万。
关键字: β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-gluc;β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-gluc;
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