产品简介
考马斯亮兰 G-250 染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的吸收峰的位置(Imax),由 465nm 变为 595nm,在一定的浓度范围内,测定的吸光度值 A595 与蛋白质浓度成正比。Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响,样品中巯基乙*醇的浓度可高达 1M,二硫苏糖醇的浓度可高达 5mM,但受略高浓度的去垢剂影响,需确保 SDS的浓度低于 0.1%,Triton X-100 低于 0.1%,Tween 20, 60, 80 低于 0.06%。含去垢剂的样品推荐使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
操作说明
一.微孔酶标仪法
1. 完全溶解蛋白标准品,取 10μL,稀释至 250μL ,使终浓度为 0.2mg/ml。待测蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见,也可以用 0.9%NaCl 或PBS 稀释标准品。
2. 5×G250 染色液使用前请颠倒 3-5 次混匀,取 1ml 5×G250 染色液,加入 4ml 双蒸水,混匀成 1×G250染色液,此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。
3. 将标准品按 0,2,4,6,8,12,16,20 微升分别加到 96 孔板中,加 PBS 稀释液补足到 20 微升。
4. 将样品作适当稀释(多做几个梯度,如作 2 倍、4 倍、8 倍稀释),加 20 微升到 96 孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差,标准线前面的点可能不很准确,所以尽可能的让样品点落在标准线 1/2后。
5. 各孔加入 200 微升稀释后的 1×G250 染色液,室温放置 3-5 分钟。
6. 用酶标仪测定 A595,或 560-610nm 之间的其它波长的吸光度。
7. 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
二.分光光度计法
如无酶标仪,染色反应可在离心管中进行,反应液混匀后加入比色皿中,使用分光光度计测定吸光值。步骤如下:
1. 取八支(或者更多)干净的 10ml 离心管,标记上号。
2. 取 100μLBSA 加入 PBS 2.4ml 稀释至终浓度为 0.2mg/ml。
3. 5×G250 染色液使用前请颠倒 3-5 次混匀,取 10ml 5×G250 染色液,加入 40ml 双蒸水,混匀成 1×G250 染色液,此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。
4. 按下表加入试剂(以每孔 5ml 计,多余的用来清洗比色皿)