戈雷拉肽性质、用途与生产工艺
戈雷拉肽又叫N-乙酰基-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸(N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro)，简 写为Ac-S-D-K-P，它是一个氮端乙酰化的内源性四肽，广泛分布于体内各种组织及体液中。这个四肽主要由它的前体物胸腺素β4经由脯氨酰寡肽酶(POP)水解而释放。在血液中的浓度一般为纳摩尔级。
戈雷拉肽的药代动力学研究发现，戈雷拉肽静脉注入体内后，很快就被降解，半衰期仅为4～5min。戈雷拉肽在人体内通过两种机制从血浆中清除：①血管紧张素转换酶(ACE)介导的水解作用；② 肾小球滤过作用。其中血管紧张素转换酶(ACE)介导的水解作用是戈雷拉肽代谢的主要途径。
戈雷拉肽是一种多功能性生理调控因子，具有多种生物学活性。早期报道，戈雷拉肽可以通过阻止原始造血干细胞进入S期，使其静止在G0期，而抑制造血干细胞的活性。随后发现戈雷拉肽通过促进血管的生成可以提高表皮的再植能力，加速受损的无血管表皮移植的伤口愈合。戈雷拉肽能够抑制MGM刺激的骨髓 干细胞分化成巨噬细胞，从而起到抗炎作用。近来发现戈雷拉肽对多种细胞的增殖具有抑制作用。
戈雷拉肽为多肽类有机物，可用作医药原料。
1.肽树脂的合成
(1)制备Fmoc-Pro-树脂：
称取5克2-氯-三苯氯甲基树脂，用二氯甲烷(DCM)100ml浸泡60分钟，在上述的树脂中，加入DIEA 4.5ml，3.38g Fmoc-Pro-OH，25℃反应2小时，再加入封闭试剂甲醇1.5ml，25℃反应2小时，树脂用35ml异丙醇洗涤两次、再用35ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗两次，获得Fmoc-Pro-树脂；
(2)制备Fmoc-Lys(Boc)-OH树脂：
在步骤(1)的Fmoc-Pro-树脂中，加入35ml脱帽试剂，25℃反应10分钟，用真空泵抽干，重新加入35ml脱帽试剂25℃反应30分钟，抽干，用35ml异丙醇洗涤2 次，35mlDMF洗涤2次，重蒸馏的35mlDMF洗涤2次，取少量树脂加4ml茚三酮试剂， 沸水中加热3min，检测结果呈阳性。加入用重蒸馏的DMF溶解的4.69gFmoc-Lys(Boc) -OH、2mlDIEA、3.22gTBTU、5mlHOBt的混合物，22℃反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，取少量树脂加4ml茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性。获得Fmoc-Lys(Boc)-Pro-树脂；
所述的脱帽试剂的组分和体积比为：PIP∶DMF＝1∶2.5，下同；
(3)制备Fmoc-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂：
在步骤(2)的Fmoc-Lys(Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件 同步骤(2)；加入用重蒸馏的DMF溶解的4.12g Fmoc-D-Asp(otBu)-OH、2mlDIEA、3.22gTBTU、5mlHOBt的混合物，22℃反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2 次，DMF洗涤2次，取少量树脂加4ml茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴 性，抽干，取少量树脂加4ml茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性。获 得Fmoc-D-Asp(otBu)--Lys(Boc)-Pro-树脂；
其余操作以及工艺条件同上；
(4)制备Fmoc-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂：
在步骤(3)的Fmoc-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤(2)；加入用重蒸馏的DMF溶解的3.84g Fmoc-Ser(tBu)-OH、2mlDIEA、 3.22gTBTU、2mlHOBt的混合物，22℃反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2 次，DMF洗涤2次，抽干，取少量树脂加4ml茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测 结果呈阴性，获得Fmoc-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂；
(5)制备Ac-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)--Lys(Boc)-Pro-树脂(肽的乙酰化)：
在步骤(4)的Fmoc-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤(2)；加入6ml乙酸酐、50mlDCM、3mlDIEA的混合物，22℃反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次、DMF洗涤2次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60分钟，抽干，用氮气吹干肽树脂成干颗粒，所得到的肽树脂为获得Ac-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂；
2.肽树脂的切割分离
把吹干的Ac-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20℃的切肽试剂(TFA∶H2O＝95∶5，体积比)80ml，20℃反应1.5小时，过滤除去树脂，加-20℃的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用冷乙醚洗涤1次，低温冷冻干燥16小时，获得四肽异构体粗品2.1g；
3.对四肽异构体粗品的分离纯化
(1)样品准备：将四肽异构体粗品溶于水溶液中，过滤，备用。
(2)四肽异构体粗品HPLC分析：取滤液20μl用HPLC分析，色谱条件：C18色谱柱 (Hypersil-ODS2，Φ5um 4.6×250mm)，流动相：A：0.1％三氟乙酸加99.9％水；B： 0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈；梯度洗脱；流速为1ml/min；检测波长为：215nm；
(3)四肽异构体粗品HPLC纯化：
取滤液3ml用HPLC纯化，选用C18色谱柱(Hypersil-ODS2，Φ5um 10×250mm)， 流动相：A：0.1％三氟乙酸加99.9％水；B：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈；梯度洗脱； 流速为10ml/min；检测波长为：215nm；收集目标峰液，样品峰合并后去盐，冻干， 获得四肽异构体纯品1.56g。
(4)四肽异构体纯品分析：
取少量样品，配成0.5mg/ml，过滤，取20μl用HPLC分析，条件同四肽异构体 粗品HPLC分析条件。
本实施例中，戈雷拉肽粗品的纯度为91.8670％，收率为 74.3％，纯度为98％(HPLC归一化法)。
N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro is degraded specifically by ACE, and its plasma level rises substantially during ACE inhibitor therapy. Flow cytometry of rat cardiac fibroblasts treated with N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro shows significant inhibition of the progression of cells from G0/G1 phase to S phase of the cell cycle. Moreover, phosphorylation and nuclear translocation of Smad2 is decreased in cardiac fibroblasts treated with N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro. N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline appears to exert this function by blocking the action of a stem cell-specific proliferation stimulator and acts selectively on quiescent progenitors. N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro inhibits collagenase expression and activation is associated with increased expression of TIMP-1 and TIMP-2. N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro normalizes the IL-1β-mediated increase in MMP-2 and MMP-9 activities and MMP-13 expression.
N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro prevents hypertension-induced inflammatory cell infiltration, collagen deposition, nephrin downregulation and albuminuria, which could lead to renoprotection in hypertensive mice.
参考质量标准
外观:白色粉末
纯度(HPLC) ≥98.0%
醋酸根含量≤12.0%
水分含量≤8.0%
肽含量≥80.0%
内毒素≤50EU/mg
氨基酸组成分析≤±10%
戈雷拉肽
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