背景[1-3]
大鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA KIT用于测定人血清，血浆及相关液体样本中2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)的含量。
实验原理：
试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)水平。用纯化的人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)，再与HRP标记的2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)浓度。
大鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA KIT
操作步骤
1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在、第二孔中分别加标准品100μl，然后在、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为2400nmol/L，1600nmol/L，800nmol/L，400nmol/L，200nmol/L。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育3 0分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
应用[4][5]
用于利用重组大肠杆菌生产2，3-二磷酸甘油酸的研究
2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG,2,3-Bisphosphoglycerate）是生命体内糖酵解途径的中间产物1,3-二磷酸甘油酸（1,3-BPG,1,3-Bisphosphoglycerate）的同分异构体,由仅存在于血红细胞和胎盘中的酶——二磷酸甘油酸变位酶（BPGM,Bisphosphoglycerate mutase,旧称DPGM,diphosphoglycerate mutase）催化1,3-BPG生成。最早于1925年被发现的2,3-BPG直到上世纪60年代其功能才由Benesch等人阐明。
因为2,3-BPG是血红蛋白的别构调节物,与血红蛋白等摩尔结合,因此是调节O2和血红蛋白亲和力的重要因素。当血液流经组织时,高含量的2,3-BPG的存在能显著增加O2的释放并供组织需要。
因此,2,3-BPG在预防和治疗高原反应,提高运动员身体机能等方面有着极大的应用价值。鉴于目前尚无人工合成2,3-BPG的报道,也无合适方法从血液中富集回收,运用基因工程的方法来进行2,3-BPG的生产。因为大肠杆菌中不存在BPGM,也不存在2,3-BPG。因此将表达BPGM的质粒pET30c-BPGM转入大肠杆菌并以IPTG进行诱导,通过向培养基中加入葡萄糖,利用大肠杆菌的糖酵解途径来生产2,3-BPG。
资料显示BPGM在Cl-的存在下主要发挥磷酸酶活性将2,3-BPG分解为3-PGA和无机磷,通过孔雀石绿法定磷法检测无机磷在630nm的吸光度,根据无机磷标准曲线得到发酵产品中2,3-BPG的含量。在培养条件上,摸索到合适的葡萄糖浓度为10g/L,合适的诱导时间为4 h,并发现在诱导时加入终浓度0.5%的Tween 80可以促进2,3-BPG穿过大肠杆菌细胞壁分泌入培养基。为接下来的回收纯化工作打下了良好的基础。
参考文献
[1]Metabolic pathway analysis of enzyme-deficient human red blood cells[J].BioSystems.2004(1)
[2]Bisphosphoglycerate mutase and pyruvate kinase activities during maturation of reticulocytes and ageing of erythrocytes[J].J.Luque,M.D.Delgado,P.Rodriguez-Horche,M.T.Company,M.Pinilla.Bioscience Reports.1987(2)
[3]Lactoylglutathione lyase,a critical enzyme in methylglyoxal detoxification,contributes to survival of Salmonella in the nutrient rich environment[J].Sangeeta Chakraborty,Mayuri Gogoi,Dipshikha Chakravortty.Virulence.2015(1)
[4]Proteomic analysis indicates that overexpression and nuclear translocation of lactoylglutathione lyase（GLO1）is associated with tumor progression in murine fibrosarcoma[J].Yufeng Wang,Yasuhiro Kuramitsu,Kazuhiro Tokuda,Futoshi Okada,Byron Baron,Junko Akada,Takao Kitagawa,Kazuyuki Nakamura.ELECTROPHORESIS.2014(15)
[5]黄晚.利用重组大肠杆菌生产2，3-二磷酸甘油酸的研究[D].复旦大学,2010.