背景[1-3]
大鼠瘦素(LEP)ELISA试剂盒采用的是双抗夹心酶联免疫吸附检测技（ELISA）。测定样品中大鼠瘦素水平。向预先包被了抗大鼠瘦素抗体的酶标孔中，加入标准品或样本，温育后，加入生物素标记的抗瘦素抗体。再与HRP标记的链霉亲和素结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入显色底物TMB，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。最后，在450 nm处测定反应孔样品吸光度（OD）值，样本中的大鼠瘦素浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线计算出样本中大鼠瘦素的浓度。
大鼠瘦素(LEP)ELISA试剂盒
大鼠瘦素(LEP)ELISA试剂盒样本收集及储存
1.细胞培养上清：
将细胞培养基移至无菌离心管，在4°C条件下1000 X g离心20 min，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。
2.血清样本：
室温下血液自然凝固后，在4°C条件下1000 X g离心20 min，取上清即可检测。
3.血浆样本：
将全血收集到含抗血凝剂的管中，抗凝剂推荐使用EDTA钠盐，样品采集后30 min内于1000 Xg离心15 min，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。
4.组织匀浆：
用预冷的PBS（0.01 M,pH=7.4）冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1 g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎。最后将匀浆液5000 X g离心5-10 min，取上清检测。
5.细胞提取液：
贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000 X g离心5 min后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每1×106个细胞中加入150-200μlPBS（建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂）重悬并通过反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500 X g离心10 min，取上清检测。
大鼠瘦素(LEP)ELISA试剂盒操作程序
1.预先计算好所需的板条数，实验前30 min，拿出试剂盒，恢复至室温。
2.每个反应孔中加入100μl标准品工作液或检测样本（若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样），标准品需做复孔，封板后于37°C孵箱孵育90 min。
3.弃去液体，甩干，每个反应孔中加入100μl生物素标记瘦素抗体工作液至反应孔中，封板后于37°C孵箱孵育60 min。
4.洗涤：弃去液体，甩干，每个反应孔中加入350μl洗涤液，浸泡1-2 min，甩干洗涤液。重复4次。
5.每个反应孔中加入100μl HRP标记链霉亲和素工作液至反应孔中，封板后于37°C孵箱孵育30min。
6.洗涤：每个反应孔中加入300μl洗涤液，间隔30 s，甩干洗涤液。重复4次。
7.每个反应孔中加入90μl显色剂（避光）至反应孔中，封板后于37°C避光显色15 min左右。
8.每个反应孔中加入50μl终止液，即刻用酶标仪450 nm波长下测量OD值（5 min内）。
9.用酶标仪450 nm波长测定OD值。
10.计算标准品、样品的平均OD值：每个标准品和样本的OD值应减去零孔的OD值。
11.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用“四参数logistics模型”绘制标准曲线。
12.若样本OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。
应用[4][5]
大鼠瘦素(LEP)ELISA试剂盒可以用于游泳训练对肥胖大鼠脂肪因子及Irisin表达调控的研究
通过对高脂饮食诱导的肥胖雄性SD大鼠进行游泳运动,研究运动干预对肥胖大鼠脂代谢的影响,探讨运动干预对脂肪因子(ADP、LEP)及肌肉因子Irisin的调控作用,为运动干预对肥胖的预防与治疗从分子生物学的角度提供一定的理论依据,以及为临床开发靶向治疗肥胖相关药物提供一定的指导。
方法:雄性SD大鼠80只,随机分为3组,其中对照组(C)10只、高脂饮食运动组(HDE)15只、高脂饮食组(HD)55只用于肥胖造模。HDE在高脂饮食的同时进行16周游泳运动,第1周进行3天适应性游泳,之后每天进行游泳训练90分钟,每周训练6天休息1天。HD组8周高脂饮食肥胖造模后,选取体重与造模前有显著性差异的30只肥胖大鼠,将其分为肥胖组15只(O)和肥胖运动组15只(OE),随后给予OE组8周同样强度的游泳运动干预。游泳运动结束后24 h内收集大鼠血液和腓肠肌,血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的水平通过生化试剂盒检测;血清Irisin水平通过大鼠瘦素(LEP)ELISA试剂盒进行测定;蛋白免疫印迹法用于检测腓肠肌内相关脂肪因子如脂联素(ADP)、瘦素(LEP)及肌肉因子Irisin信号通路相关的蛋白AMPK、PGC-1α的表达。
大鼠瘦素(LEP)ELISA试剂盒结果1)O组大鼠在造模成功和实验结束时,其体重都显著高于C组(p<0.05);游泳运动干预后,HDE组大鼠体重较O组显著性地降低(p<0.05);2)游泳运动干预后,O组和OE组大鼠血清TC水平均显著高于C组及HDE组(p<0.01和p<0.05);对于血清HDL水平,O组显著低于C组(p<0.05)及HDE组(p<0.01),OE组显著性低于HDE组(p<0.05)。3)游泳运动干预后,O组大鼠血清Irisin水平显著性低于C组及HDE组(p<0.05)。4)通过蛋白免疫印迹法对运动干预肥胖相关因子的蛋白表达进行测定,结果显示:O组LEP表达水平较C组显著上调(p<0.05),较HDE和OE组明显上调(p<0.05);而ADP表达水平,O组较C显著下降(p<0.05),OE组较C组和O组均显著上调(p<0.05)。
参考文献
[1]Effects of a 1‐year exercise and lifestyle intervention on irisin,adipokines,and inflammatory markers in obese children[J].Susann Blüher;;Grigorios Panagiotou;;David Petroff;;Jana Markert;;Antje Wagner;;Thorsten Klemm;;Andreas Filippaios;;Alexandra Keller;;Christos S.Mantzoros.Obesity,2014(7)
[2]Does IRISIN Have a BRITE Future as a Therapeutic Agent in Humans?[J].Brian A.Irving;;Christopher D.Still;;George Argyropoulos.Current Obesity Reports,2014(2)
[3]Adipose Tissue as an Endocrine Organ[J].Nicolas Musi;;Rodolfo Guardado-Mendoza.Cellular Endocrinology in Health and Disease,2014
[4]Cardiac,skeletal muscle and serum irisin responses to with or without water exercise in young and old male rats:Cardiac muscle produces more irisin than skeletal muscle[J].Suna Aydin;;Tuncay Kuloglu;;Suleyman Aydin;;Mehmet Nesimi Eren;;Ahmet Celik;;Musa Yilmaz;;Mehmet Kalayci;;İbrahim Sahin;;Orhan Gungor;;Ali Gurel;;Murat Ogeturk;;Ozlem Dabak.Peptides.2014
[5]袁红.游泳训练对肥胖大鼠脂肪因子及Irisin表达调控的研究[D].武汉体育学院,2015.
参考文献
[1]Effects of a 1‐year exercise and lifestyle intervention on irisin,adipokines,and inflammatory markers in obese children[J].Susann Blüher;;Grigorios Panagiotou;;David Petroff;;Jana Markert;;Antje Wagner;;Thorsten Klemm;;Andreas Filippaios;;Alexandra Keller;;Christos S.Mantzoros.Obesity,2014(7)
[2]Does IRISIN Have a BRITE Future as a Therapeutic Agent in Humans?[J].Brian A.Irving;;Christopher D.Still;;George Argyropoulos.Current Obesity Reports,2014(2)
[3]Adipose Tissue as an Endocrine Organ[J].Nicolas Musi;;Rodolfo Guardado-Mendoza.Cellular Endocrinology in Health and Disease,2014
[4]Cardiac,skeletal muscle and serum irisin responses to with or without water exercise in young and old male rats:Cardiac muscle produces more irisin than skeletal muscle[J].Suna Aydin;;Tuncay Kuloglu;;Suleyman Aydin;;Mehmet Nesimi Eren;;Ahmet Celik;;Musa Yilmaz;;Mehmet Kalayci;;?brahim Sahin;;Orhan Gungor;;Ali Gurel;;Murat Ogeturk;;Ozlem Dabak.Peptides.2014
[5]袁红.游泳训练对肥胖大鼠脂肪因子及Irisin表达调控的研究[D].武汉体育学院,2015.