新生霉素的抗菌作用与青霉素和红霉素相似、对葡萄球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、脑膜炎球菌等有很强抗菌作用。耐青霉素G的金葡菌对新生霉素仍敏感，革兰阴性杆菌中除嗜血杆菌外对本品大多不敏感。新生霉素对真菌、立克次体、病毒、原虫等均无作用。本品为抑菌剂，但在高浓度时也有杀菌作用。细菌对新生霉素易产生耐药性，其作用机制主要抑制细菌蛋白质和核酸的合成，同时也可损伤细胞膜和干扰细胞壁的合成。
新生霉素口服后血浓度于服药后2～4小时到达高峰，有效浓度可维持12小时之久，口服后的血半寿期为3小时，与血清蛋白结合率可达95%，新生霉素在体内分布甚广，尤以肝、胆汁中浓度为高，其胆汁浓度约为血浓度的2～8倍，约1/3的口服量自粪便排出，仅约2～3%的新生霉素出现于尿中，本品不易进入脑脊液。乳汁浓度可达血浓度的6～25%。
新生霉素可引起多种副作用，以皮疹和胃肠道症状最多见，如恶心、呕吐、腹泻等，此外有药物热、黄疸、白细胞减少、粒细胞减少等，偶有头晕、视力模糊、过敏性肺炎或心肌炎、血管神经性水肿、血尿及肝功能损害等。由于以上缺点，目前本品临床已少用，仅用于对常用抗菌药物耐药的葡萄球菌感染，如软组织感染、脓皮病、中耳炎、支气管炎，肺炎等。由于单独使用时细菌易产生耐药性，因此常与其他抗生素如氨基糖甙类、利福平、磺胺药等合用。但静滴时不宜与碱性抗生素如链霉素、红霉素等合用，因可形成不溶于水的盐类。新生霉素可以口服、肌内注射或静脉滴注。口服最常用，成人剂量每日1～2g，分3～4次口服；儿童剂量每日25～50mg/kg，分次口服。肌内注射和静脉注射因可引起局部刺激，故较少用，剂量为每日20～30mg/kg，静脉注射时必须用注射用水或生理盐水溶解。肝功能不全者慎用。
