谷胱甘肽

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物，是哺乳动物细胞中抗氧化胁迫最重要的低分子硫醇。在1921年被发现,1930年确定化学结构,美国著名营养保健专家艾尔·敏德尔博士称谷胱甘肽为三倍效能的抗衰老氨基酸，又被称为大自然的抗氧化大师，外观为无色透明细长粒状晶体，溶于水、稀醇、液氨、二甲基甲酰胺，不溶于乙醇、醚、丙酮。固体时其性状稳定，其水溶液在空气中易被氧化为氧化型谷胱甘肽，广泛存在于面包酵母、小麦胚芽、动物肝脏、鸡血、猪血、西红柿、菠萝、黄瓜中，其中以小麦胚芽和动物肝脏中最高，含量高达100～1000mg/100g。具有抗氧化、清除自由基、解毒、增强免疫力、延缓衰老、抗癌、抗放射线危害等功能。也有助于白血细胞杀死细菌，防止维生素C和E氧化，预防中风和白内障形成。此外，谷胱甘肽还有绑定致癌物，将它们通过尿液排出体外的作用。
肝脏是人体最重要的解毒器官，其内所含丰富的谷胱甘肽(GSH)对肝脏的合成、解毒、雌激素灭活等功能起保护作用。是人体抵消自由基损害的首要抗氧化剂，自由 基是导致衰老和疾病的促成因子。当肝脏受到损伤，比如患有各种肝病时，人体将消耗大量的GSH来帮助受伤的肝脏进行自我修复和解毒，从而引起体内的谷胱甘肽 大幅度减少。而这个时候我们需要服用一些谷胱甘肽类药物，有利于受伤的肝脏进行自我修复。因而，谷胱甘肽类药物适用于病毒性肝炎(如甲肝、乙肝等)、酒精 性肝病、药物性肝病、脂肪肝等肝脏疾病，是肝病患者的护肝良药。谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物，化学名为γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，其结构式如图1所示。从图中结构式可知，GSH与其他肽及蛋白质有所不同，它的分子中有一特殊肽键，是由谷氨酸的γ-羧基(—COOH)与半胱氨酸的α-氨基-(—NH2)缩合而成的肽键。

图1：谷胱甘肽(GSH)的化学结构式
谷胱甘肽生物合成是直接由其合成酶系控制，而非像蛋白质合成一样是在核糖体上进行的，谷胱甘肽的生物合成包括下列两个反应，如图2所示。

图2：谷胱甘肽的合成
早在1921年Hopkins首先发现谷胱甘肽，就将谷胱甘肽分为还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两类。GSH存在于所有生物细胞中，而以酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量极高，达100～1000mg/100g。据最近资料报道，S.cerevisiae JN-5-8菌株GSH含量可达3058mg/100g。在干酵母中以氧化型谷胱甘肽存在，而人红细胞中几乎全部是还原型谷胱甘肽，GSH可以在红细胞内合成。谷胱甘肽分子中含有一个活泼的巯基—SH，易被氧化脱氢，两分子的还原型谷胱甘肽(GSH)脱氢变为一分子的氧化型谷胱甘肽(GSSG)。氧化型中两个三肽由二硫键连在一起，在生物体中起重要生理功能作用的是还原型谷胱甘肽，GSSG需还原成GSH才有生理活性。

谷胱甘肽的分子量为307.33，熔点189～193℃ (分解)，晶体呈无色透明细长柱状，等电点为5.93。它溶于水、稀醇、液氨和甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。生物体内只有GSH才具有生理活性，而GSSG需还原后才能发挥其重要的生理功能。GSH在高水分活性下不易保存，只有将水分活性控制在0.3以下才能够长期稳定保存。有研究显示，在含有GSH的维生素C水溶液(pH3.3)中，由于有维生素C的强还原作用，溶液中的GSH不会氧化为GSSG，但其分解速度却加快；而存在于维生素C水溶液中的GSSG也不会转变为GSH，且保存稳定性很好。并且经口摄入的GSSG在小肠上部可被还原为GSH，在小肠上皮细胞表面经γ-GTP(将GSH分解为谷氨酸与Cys-Gly)及二肽酶的作用而被吸收，同样可以发挥其重要的生理功能。
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谷胱甘肽广泛存在于动、植物中，在面包酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量极高，达100～1000mg/100g；在人和动物的血液中含量也较丰富，如人血液中含26～34mg/100g、鸡血中含58～73mg/100g、猪血中含10～15mg/100g、狗血中含14～22mg/100g。许多蔬菜、薯类和谷物中也含有GSH (见表1)。

1、加入到面制品中，可起到还原作用。不仅使制造面包的时间缩短至原来的二分之一或三分之一，劳动条件大幅度改善，并起到食品营养的强化作用及其他功能。
2、将其加入到酸奶和婴幼儿食品中，相当于维生素C，可起到稳定剂的作用。
3、将其拌到鱼糕中，可防止色泽加深。
4、加到肉制品和干酪等食品中，具有强化风味的效果。

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洋葱、大蒜、西红柿、鱼、虾、羊肉、辣椒。还原型谷胱甘肽(GSH)是细胞内一种重要物质，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，含有巯基，为维持细胞生物功能发挥重要作用，具有多种生化功能，包括参与三羧酸循环及糖代谢，是甘油醛磷酸脱氢酶和磷酸丙糖脱氢酶的辅酶，能激活多种酶，促进糖、脂肪及蛋白质代谢，影响细胞的代谢过程；通过巯基与体内的自由基和亲电子基结合，转化为容易代谢的酸类物质，加速自由基的排泄，使细胞免受损，减轻化疗、放疗的毒性作用，保护肾小管免受顺铂的损害。GSH可与亲肝毒物结合，保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能，促进胆酸代谢，有利于消化道吸收脂肪及脂溶性维生素。适用于减轻化疗、放疗，尤其是大剂量化疗时的毒性作用；或用于治疗各种低氧血症，如急性贫血、急性呼吸窘迫综合征、败血症等；可用于肝脏疾病，包括病毒性、药物性、乙醇性及其他化学毒性引起的肝脏损害的治疗。此外还原型谷胱甘肽还可用于有机磷、氨基或硝基芳香化合物中毒的辅助治疗。对急性药物性肾损伤、尿毒症、糖尿病并发症和神经病变亦有治疗作用。谷胱甘肽有广谱的解毒作用，能与进入机体的有毒化合物如丙烯腈、氟化物、一氧化碳、重金属离子或致癌物质等相结合，并促进其排出体外，可用于上述物质中 毒症的治疗。有抗过敏作用，能治疗人体内乙酰胆碱、胆碱酯酶的失衡引起的过敏。有保护肝脏、抑制脂肪肝形成的作用，不仅可作护肝剂，而且能作饲料添加剂，有对鱼、牛的护肝作用。在养殖中由于过密放养与饲料不洁往往导致鱼、乳牛中出 现肝功能障碍，加入谷胱甘肽能改善肝功能。在谷胱甘肽结合中，谷胱甘肽经谷胱甘肽-S-转移酶的催化与外源化学物或其代谢产物结合，从而降低毒性和增大极性，是生物转化中一个较重要的解毒途径。当适合于这一反应的外源化学物剂量较大时，可能使谷胱甘肽耗竭，出现代谢饱和(metabolic saturation)，从而在单位时间内结合的量不再随该外源化学物剂量增加而增加。于是该相应外源化学物的毒性大增，其剂量反应曲线与低剂量时极不致，其毒物动力学也表现为非线性动力学。谷胱甘肽耗竭不一定单是某种外源化学物剂量过大，也可能因另一种外源化学物竞争该结合作用，或因营养低下或组织损伤使谷胱甘肽供应减少。任一情况产生的谷胱甘肽耗竭都可使本来耐受的剂量产生毒作用。人体内的许多生化反应都是酶催化反应，这些酶大部分以巯基作为活性基团，巯基的状态决定了酶活性的激活与抑制。谷胱甘肽是这些酶在细胞内的天然激活剂, 所含有巯基能将人体细胞新陈代谢生成的H2O2还原成H2O，清除人体内的自由基。自由基会损伤细胞膜，促进机体衰老，并诱发肿瘤或动脉硬化。对人体细胞有防过氧化作用，还能改善皮肤的抗氧化能力，使皮肤产生光泽。人体衰老、感染、中毒、外源性毒素、氧化应激、亲电化合物攻击都可以使细胞浆内的GSH水平会降低，此现象发生在细胞凋亡非常早的阶段，在凋亡早期能观测到其降解过程，因此检测谷胱甘肽的水平可以早期判断和检测凋亡。
谷胱甘肽有消除氧化脂质生成的功能，并有抗油脂氧化作用，还可防止呈味核苷酸（肌苷酸、鸟苷酸）食品（鱼糕、香肠、酱油等）中的呈味核苷酸分解而失去鲜厚味。自1938年发表了用酵母制备还原型谷胱甘肽（GSH）的最早专利之后，此后又有大量专利申请。总的说来，目前GSH的制备方法有溶剂萃取法、酶法、发酵法和化学合成法四种。目前主要从培养高含量GSH酵母中提取，国内生产厂家有上海酵母厂以及多家院校、研究单位正在试制开发，国外重要生产厂家有J.T.Baker、BDH、Fluka、E.Merck、Riedel-de Haen、Siqma及日本和光纯药等公司。
萃取法和酶法大多以小麦胚芽为原料，通过添加适当溶剂或结合用淀粉酶、蛋白酶处理，再经离心、分离和精制而成。其工艺流程简单，见下图4。

图4：从小麦胚芽中提取谷胱甘肽的工艺流程
通过生物技术途径制备谷胱甘肽有两种方法，一种是选育富含GSH的高产酵母菌株，再由此分离提取制得，图5给出简单的工艺流程。另一种方法是通过培养富含GSH 的绿藻，再用与酵母相似的方法提取。

图5：从酵母细胞中提取谷胱甘肽的工艺流程本试剂盒用于测定鱼血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中谷胱甘肽(GSH)的含量。本试剂盒应用双抗体夹心法测定鱼标本中谷胱甘肽(GSH)水平。用纯化的谷胱甘肽(GSH)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入谷胱甘肽(GSH)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽(GSH)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中谷胱甘肽(GSH)含量。1、组织标本 对于样本要求保持鲜重，称取样本中的重量不小于50mg，一般以1g为基准,但不严格要求固定样本每个重量必须达到相同的水平。匀浆的比例选取10%，相当于1g组织加9ml的匀浆液来进行匀浆。匀浆液选取PBS（PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol/L）。匀浆过程选用组织匀浆器，冰浴上匀浆。(或者进行液氮碾磨)，离心取上清，离心转速选用5000转每分，时间是15分钟。取上清液待检。 2-1、贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细 胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS 洗涤3次。每 1×106 个细胞中加入150-200μL PBS重悬并通过反 复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清检测。 2-2超声波破碎条件：用20kHz频率，150W的功率，在冰浴中进行超声波破碎，每破碎2s，间隔3s，反复破碎三次。 2-3反复冻融：收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-20℃ 冷冻30 min，37℃解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。 3、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 4、不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），测定应在加终止液后15分钟以内进行。外观:白色粉末
纯度(HPLC) ≥98.0%
醋酸根含量≤12.0%
水分含量≤8.0%
肽含量≥80.0%
内毒素≤50EU/mg
氨基酸组成分析≤±10%

谷胱甘肽可用作生化试剂、解毒药，主要用于重金属、丙烯腈、氟化物、一氧化碳及有机溶剂等中毒处理。

还原型谷胱甘肽是一种小分子的肽，大量存在于生物体中，尤其是肝细胞中，有保护肝细胞膜，促进肝酶活性的作用，并与众多有毒化学物质结合起到解毒的作用。对药物中毒，酒精中毒等各种原因引起的肝脏所伤，肝硬化等疾病有很好的疗效。具有抗氧化、清除自由基、解毒、增强免疫力、延缓衰老、抗癌、抗放射线危害等功能。在细胞代谢和突发性呼吸期间形成的活性氧还原中发挥重要作用的内源性抗氧化剂。谷胱甘肽-S-转移酶催化谷胱甘肽硫醚与异生物、白三烯和其他具有亲电中心的分子的形成。谷胱甘肽还与蛋白质中半胱氨酸残基形成二硫键。通过这些机制，它可具有降低抗癌剂效用的奇异效果。