纳豆激酶

纳豆激酶纳豆在发酵过程中，由纳豆枯草杆菌产生一种丝氨酸蛋白酶。纳豆激酶具有纤溶活性，可以治疗和预防血栓疾病。

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英文名：NattoKinase
结构类型：单链多肽，碱性蛋白酶
1.纳豆激酶的稳定性
pH稳定性
在自然pH值状态下，相对比较稳定，在pH值从7升至12时，室温下10min内稳定；pH值低于5时，则极为不稳定，很快失去活性；当温度超过60时则迅速因蛋白变性而失活。反复冻融五个循环时，其活性仍保存95%以上，从而表明冻融对纳豆激酶的活性无较大影响。当纳豆激酶与煮沸的小麦提取液、煮沸的肉汤以及血清蛋白和胃粘液蛋白混合后，纳豆激酶的稳定有明显增加，甚至在酸性pH值时，酶活性也并不完全失掉。
热稳定性
在温度低于45°C时活性相对稳定，高于60°C则因蛋白质变性而迅速失活，冻融对纳豆激酶的活性无较大影响，反复冻融5次后，该酶仍能保持95%以上的活性。
金属离子稳定性
纳豆激酶的活性还受一些金属离子的影响，Hg2+会使其完全失活，Cu2+、Zn2+、Al3+、Ca2+等离子对该酶有不同的抑制作用，而Mg2+、Co2+则对其有激活作用。
其他物质稳定性
E-ACA和EDTA对纳豆激酶活性无明显影响，而PMSF能完全抑制其活性。1mmol/L的DFP和neguvon则能完全抑制纳豆激酶的活性。
2分子量
纳豆激酶是一种单链多肽酶，由于测定分子量的技术方法不同，因此所测得到的分子量也有明显不同。用SephadexG100柱凝胶过滤法，得到的结果为20000，用园二色方法测定为27300。根据氨基酸顺序计算出该酶的准确分子量为27.728。
3.PI值（等电点）
用Svunsson的柱型电泳法，等电聚焦测定纳豆激酶具有对称的单一的纤溶酶峰，其PI值为8.6±0.3。等电点可以提供在分离提纯纳豆激酶时，考虑调pH值在PI值附近，有利于酶的纯化。
4.纳豆激酶的底物特异性
NK作为丝氨酸蛋白酶，其酰胺水解活性可通过许多合成底物进行观察。对纳豆激酶最敏感的底物为血浆纤溶酶的底物，即S2251；对底物H2DLArgPNA，S2238，S2266和S2302具有一定的活性，而对S2444和S2484则明显地无活性。纳豆激酶有其特异的水解蛋白的氨基酸作用和识别位点。纳豆是种古老的传统食品，起源于我国的秦汉时期，大约在唐朝时期由禅僧传入日本，至今已有一千多年的历史。
纳豆(Natto)是日本的一种传统的发酵豆制品，由纳豆菌(Bacillusnatto)在一定温度、湿度下发酵蒸煮大豆而成，作为日本人的主要佐餐食品已有两千多年的历史，在民间一直药食兼用。成熟的纳豆色泽金黄，表面覆有一层黏性物质，挑起时有长长的拉丝状物质。纳豆风味独特，营养丰富，具有多种保健功能，被誉为“超级健康食品”，深受日本人民的喜爱。目前，纳豆已成为盛行于日本、加拿大、美国和欧洲一些国家的一种保健食品，我国也有企业开始生产和销售。
纳豆在发酵过程中，纳豆菌产生一种丝氨酸蛋白酶(纳豆激酶NattoKinase)，该酶最早于1987年由日本宫崎医科大学的须见洋行等发现。
图1为纳豆纳豆在制作过程中，原料大豆经发酵使大豆蛋白质分解，纳豆的消化率从原来的50%提高到85%，因而更容易吸收。纳豆具有很高的营养价值，其蛋白质、纤维素、钙、铁、维生素B、维生素PP、维生素E的含量均高于蒸煮大豆，特别是维生素B的含量比蒸煮大豆高6倍以上。纳豆中还含有蛋白酶、多种维生素、γ-谷氨酰基转肽酶、γ-多聚谷氨酸等多种物质，同时也含有较高的活性物质，如纳豆激酶、异黄酮、大豆磷脂、糖化酶、超氧化物歧化酶(SOD)、皂甙素、生育酚、吡啶二羧酸、维生素K2等。研究表明，纳豆激酶具有纤溶活性，可以治疗和预防血栓疾病。目前，关于纳豆菌的研究和应用主要集中在纳豆激酶的作用上。但是，作为保健食品的纳豆还具有多种保健功能，如溶血栓、抗肿瘤、降血压、抗菌等作用，可预防骨质疏松、提高蛋白质的消化率、抗氧化等。
1.溶栓作用
1987年日本富崎医科大学须见洋行等首先发现，随之将提取出的纳豆激酶应用于狗的血栓作用，证明是一种有纤溶活性的酶制剂，所以定名为纳豆激酶。
对200种具有口服纤溶作用的物质进行了研究了发现纳豆激酶是目前发现的最具潜力的溶纤蛋白酶。与尿激酶、链激酶相比，体内半衰期长，能温和持续地提高血液的纤溶活性，不易引起出血。
2.溶栓机制
①使血浆压D一二聚体呈阳性，直接分解血栓，明显增高纤维蛋白降解产物FDP的含量；②激活纤溶酶原激活物，刺激血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂，溶解纤维蛋白，降解血栓，将体内的尿激酶原激活为尿激酶，尿激酶与t-PA一同激活纤溶酶原，溶解血栓。还可以灭活纤溶酶原激活剂的阻断剂PAI-1，进一步激活更多的尿激酶和t-PA，促进血纤维蛋白的溶解。而分解血栓；③抑制内源性及外源性凝血系统而达到抗栓溶栓作用。主要通过增高TT，显著降低血浆ELT和影响机体凝血因子即Fig，明显延长APTT，CT和PT；④该酶是一种丝氨酸蛋白酶，具有直接水解交联纤维蛋白的作用，但对纤维蛋白原并不敏感，故该酶发挥溶纤作用时不水解血浆纤维蛋白原，不易引起出血。
3.溶栓优点
作为溶血栓药物具有以下优点：纳豆菌被FDA认证为食品工业的安全性的细菌；纳豆激酶的分子量小，更易为人体吸收；可以由消化道吸收，因此可以成为第一个口服性溶血栓药物；可直接作用于纤维蛋白，且作用迅速；可以利用细菌发酵生产，因此造价低廉有望开发为一种安全的食用血栓预防剂。
4.其它药理作用
纳豆激酶中含有可以治疗高血压的血管紧张素转化酶抑制剂成分，因此可以进一步研究其在治疗高血压方面的应用。有研究表明，口服能明显降低深静脉血栓和肢体水肿的发生。在骨质疏松和糖尿病的预防和治疗中的也有作用。基因结构
NakamuraT于1992年首次对一株纳豆芽孢杆菌NC21中的NK基因进行了研究，报道了包括调控顺序在内的1473bp的NK全基因序列[5]。NK基因从第181个碱基开始，以GTG为起始密码子，随后是1143bp组成的阅读框架，分为三个部分(见图1):分别是信号序列(signalsequence)、前序列(prosequence)和成熟序列(maturegene)，相应的编码29个氨基酸的信号肽(signalpeptide)、77个氨基酸的前肽(propeptide)和275个氨基酸的成熟肽(maturepeptide)。结构基因的3末端为连续的三个终止密码子TAA，TAG，TAA。终止密码子之后一段序列可形成茎环结构，即因子非依赖性终止顺序。起始密码子上游17bp处为核糖体结合位点AAAGGAG。SD序列上游是一个AT含量高达72%的转录调控区域，但在此区域尚未找到与已知枯草杆菌启动子相类似的保守序列。
蛋白质结构
根据NK基因的DNA序列推出其氨基酸序列的一级结构，确定纳豆激酶由275个氨基酸组成，是一种单链多肽酶，其含有8个赖氨酸残基，肽酶可将其水解成9个小肽，该酶的活性部位在Asp32，His64，Ser221处，底物结合部位在Ser125，Leu26和Gly127处。NK基因的阅读框序列推导的氨基酸组成显示其共编码381个氨基酸，其中N端29个氨基酸组成信号肽(signalpeptide)，随后的77个氨基酸组成前肽(propeptide)，成熟肽组成与氨基酸序列测定相符。目前国内外纳豆激酶活性测定常用方法主要有：琼脂糖-纤维蛋白平板法、纤维蛋白块溶解时间法、四肽底物法、血清板法等。
如琼脂糖-纤维蛋白平板法：纤维蛋白平板法是最早用于纳豆激酶活性的测定方法之一，它以标准尿激酶、纤溶酶等作为标准品对照绘制标准曲线，从标准曲线上读取样品的酶活性。它测定的原理是将琼脂糖、纤维蛋白原和凝血酶按一定比例混合，生成的交联纤维蛋白为底物，酶活性与溶解圈面积呈线性关系。因此用溶解圈面积表示纳豆激酶的溶纤维活性。纳豆激酶的生产有固态发酵技术和液态发酵技术两种方法。如黄占旺等人从我国传统食品豆鼓中分离出纳豆芽孢杆菌菌株，并对其进行固态发酵条件研究得出纳豆芽孢杆菌菌株固态发酵适宜条件为：玉米粉与麦麸质量比为3:7，含水量60%，种龄15h，接种量5%，发酵温度37°C，发酵时间5d。周伏忠等人从原料来源容易得到、提取工艺简便易行、节能环保等方面着手，研究出一种新的纳豆激酶固体发酵方法，该方法简单工艺为：采用自选纳豆激酶生产菌株，加入鲜豆渣或干豆渣进行固体发酵，通过灭菌、接种、发酵、干燥等步骤产生纳豆激酶。
由于传统的固态发酵易染杂菌，回收率低，很难满足生物制品的严格生产要求，近年来许多学者转而研究其液态发酵方法。液态发酵纳豆激酶用培养基中的氮源一般主要以价格较高的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏等为主，有些学者从经济效益的角度，提出以纳豆枯草杆菌作为发酵菌株，利用价廉、资源丰富的豆粕浸提液作为发酵培养基的氮源进行发酵条件实验，为开发低成本的纳豆激酶液体发酵工艺技术提供了科学依据。鉴于纳豆激酶的神奇功能，国内外很多学者对纳豆食品和含纳豆激酶的保健食品进行深入开发，将其作为一种可以治疗和预防心脑血栓，冠心病，心绞痛，脑中风，老年痴呆以及各种常见多发病的功能食品向世界各地开拓市场。
1.在国际市场上，纳豆激酶产品的最大生产国家是日本，日本有多家企业推出含有纳豆激酶为主要成分的产品，并已在世界各地设有销售服务机构。据文献报道，日本每年消费纳豆22万吨，约1600亿日元，有400多家工厂生产纳豆及纳豆激酶产品，供应国内外。
2.国内方面，目前，黑龙江省科学院应用微生物研究所研制的纳豆激酶制剂——恩开胶囊已处于中试阶段。而国内企业中有北京燕京中发的燕京牌纳豆、北京龙兴的纳豆胶囊、天津百德公司的纳豆口嚼片湖南贵生坊的纳豆素胶囊等。1.科学研究表明，纳豆激酶能够有效的清除人体血液内的血栓，而且对高血压，衰老，中风，肌肉痉挛和心脑血管疾病也有很好的疗效。而血栓疾病是严重危害人类健康的主要疾病之一，如急性心肌梗塞等。全世界现有血栓塞病人约1500万，所需的溶栓药的潜在市场约20亿美元。纳豆中的活性成分纳豆激酶作为新一代的溶栓剂或保健食品，克服我国血栓溶解药物口服性差、价格昂贵、并发症多等缺点，具有极为诱人的广阔前景。
2.由于纳豆有一股特殊的氨臭味而不易被人们接受，这也致使纳豆的发展受到一定程度的限制，对纳豆中特殊氨臭味的处理成为研究的热点，我们可以将纳豆与我国传统食物的风味结合起来，通过调整产品的形态、添加风味物质、低温干燥等处理方法，去除其特殊的味道，同时又保留原有的功能特性和营养价值有关纳豆激酶分离纯化的研究报道，绝大部分采用的是传统的蛋白质分离纯化手段，交替使用沉淀、盐析、离心、过滤和色谱等技术。
1.通过硫酸铵分级沉淀、CM-SepharoseF.F.柱层析、冷冻干燥得到纳豆激酶。优化了纳豆激酶分离纯化工艺。
2.以SubtilisinCarlsberg为模拟蛋白，以AOT/isooctane反胶团体系为有机相，利用AOT/isooctane反胶团体系从发酵液中分离纯化纳豆激酶.纳豆激酶经过一次萃取循环，蛋白质回收率约为33.25%，酶活力回收率达到80.2%，纯化因子约为2.5左右.迄今为止，国外对纳豆激酶基因的研究仅限于Nakamura等利用鸟枪法得到了NK基因重组到Puc19质粒上，转化到E.coliHB101受体菌中，该基因工程菌发酵产物具有胞外蛋白酶活性，但没有检测其溶栓活性单位。至于对纳豆激酶基因的克隆、表达及表达产物的研究还未见报道，但与纳豆激酶同源性很高的枯草杆菌蛋白E和枯草杆菌蛋白酶amylosacchariticus都已有基因克隆的报道。