CRISPR/CAS9 载体设计与构建

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) /Cas (CRISPR-associated) 是最近几年出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。它是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。此系统的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点处剪切双链 DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA (guide RNA)，足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。当外源DNA入侵细菌时，其CRISPR系统会特异性地捕获一段被称为proto-spacers的外源DNA序列插入到前导序列与间隔重复序列之间，并伴随一次重复片段的复制，这样就形成了一段新的重复单元，这些重复单元就是细菌特异性免疫的结构基础。需要注意的是，外源DNA的捕获并不是完全随机的，在这些被捕获的DNA序列下游常有一段序列保守的特殊结构，被称为PAM位点PAM位点的存在可能是CRISPR系统区分自身DNA与外源DNA而避免发生自身免疫的机制之一，同时也是基因编辑时靶序列选择的重要要求。之后，形成的重复单元会被转录形成前体CRISPR RNA (Pre-crRNA)，在RNase Ⅲ的作用下成熟。成熟的crRNA与tracrRNA通过碱基配对形成双链RNA结构，并进一步与Cas9蛋白结合形成靶向切割复合体对外源DNA进行特异切割，达到识别和降解外源DNA的目的。