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酪蛋白

自从Maruyama等(1982年)首次在牛乳酪蛋白的水解物中发现了具有ACE抑制活性的小肽以来,对乳酪蛋白的研究得到了进一步的重视,对牛乳酪蛋白的潜在的生理功能的研究已经成为了科学家们研究的新热点。现已在酪蛋白、乳清蛋白、发酵酸牛乳等乳制品中发现了许多具有ACE抑制活性的小肽。用自发性高血压大鼠进行动物试验研究表明,它具有很好的降血压功能。但研究表明完整的酪蛋白没有ACE抑制活性,而其酶解产物则具有ACE抑制活性。
酪蛋白中含有多种生物活性肽,具有抗菌、降血压、抗氧化和促进歧杆菌增殖等功能。酪蛋白在母体蛋白质序列内是无活性的,通过体内或体外酶水解的方式释放出来后,它们即可作为具有类似激素活性的调节物质。这些产物可用作肽类药物、肽类试剂,主要用于科学试验和生化检测,也可用于活性肽功能性食品 中,具有增强机体防御功能、调节生理节律、预防疾病和促进康复等功能。
酪蛋白又称酪朊、酪素、干酪素、乳酪素等,指牛乳在20 ℃, pH值为4.6时,沉淀下来的蛋白质,呈酸性,是一种含磷的蛋白质,是牛奶中含量最丰富、 营养价值最高的蛋白质。其是等电点为pH=4.6的两性蛋白质,由α、β、γ和κ酪蛋白按一定比例组成的含磷复合蛋白,是乳汁的主要成分,约占30%,占乳汁中蛋白的80%。在牛奶中以磷酸二钙、磷酸三钙或二者的复合物而存在。也是干酪的主要成分,豆类中也含有少量,构造极为复杂。纯酪蛋白为白色至浅黄色颗粒状或粉,无嗅、无味,相对分子质量约为57000~375000,相对密度 1.25~1.31,不溶于水,溶于碱性溶液及浓酸,但在稀酸中沉淀,有吸湿性,干燥时稳定,吸湿后迅速变质。以磷蛋白质的形成成为重要的营养蛋白,含氮量约为15.2%。市售品含氮量约为14.7%~16.0%。
在正常奶的酸度(pH6.6)下,酪蛋白与钙、磷等结合,形成酪蛋白胶粒,在奶中以胶体悬浮液存在。酪蛋白胶粒对pH变化很敏感,当将奶的pH调至4.6时,酪蛋白形成沉淀,经离心后从奶中分离。牛奶中酪蛋白含量高,在婴儿胃中可形成乳凝块而影响蛋白质的消化吸收。酪蛋白是一种含氮量高,氨基酸种类齐全、比例较合适的优质蛋白质,生物学价值高,当对某些食物蛋白质的质量进行评价时,常用酪蛋白作为标准物或“参考蛋白质”。酪蛋白中含硫氨基酸含量相对较低。酪蛋白是重要的营养蛋白,用作食品增稠剂。用于冰淇淋、饼干、面包、花味油膏、蛋黄酱、火腿、腊肠等。还用作糖尿病食品、木材胶料、纸张涂料、生物用料、纺织浆料、水溶性涂料基料、塑料纽扣等。

结构
酪蛋白的分子质量约为20-25ku,由4类遗传变种组成,分别为αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。 其中,αs1-酪蛋白是牛乳中的主要酪蛋白,占总含量的38%(αs1-酪蛋白分子质量为23.5ku,含199个氨基酸;αs2-酪蛋白分子质量为25.2ku,含207个氨基酸;αs1-酪蛋白与αs2-酪蛋白含量比约为4:1); β-酪蛋白含量仅次于αs-酪蛋白,占总含量的35%,分子质量为24ku,209个氨基酸;κ-酪蛋白是酪蛋白中惟一含有糖成分,且对钙不敏感的酪蛋白,在牛乳中的质量分数为13%,分子质量为19ku,含169个氨基酸。这4种单体通过αs-螺旋、β-折叠和β-转角等结构构成了酪蛋白的空间结构。
研究表明,酪蛋白以胶团形式悬浮于水相体系中。对于胶团的外部形状,电镜观察显示,酪蛋白胶团呈粗糙的球形结构,而对其胶团内部结构模型的推断却一直颇受争议。胶团内部结构模型的代表性推测有:①酪蛋白胶团中心为纳米级的磷酸钙胶束,其包含酪蛋白的磷酸丝氨酸残基及谷氨酞胺残基;② 最为广泛接受的“Waugh模型”认为酪蛋白胶团呈现核-壳模式,并有亚胶团结构的存在, 即由αs和β-酪蛋白构成的亚胶团结构构成球核,外壳由κ-酪蛋白分子和磷酸丝氨酸残基(与Ca2+紧密结合)组成保护层。

稳定性
1.κ-酪蛋白对稳定性的影响
在维持胶团结构稳定性方面,κ-酪蛋白发挥着尤 为重要的作用:① 对于脯氨酸含量较高(能够阻碍形成有序的螺旋结构)的酪蛋白,仍然可以呈现为一种动态球体模式(主要是因为κ-酪蛋白的作用),κ-酪蛋白能够形成一些短的α-螺旋与β-折叠肽段,有些以脯氨酸残基为中心的α-转角与β-折叠基团组成的刚性区域受到一些弹性基团(α-螺旋与环)的束缚,这些弹性基团使得胶团处于具有一种张力与压力流变平衡的状态;② 处于胶团表面κ-酪蛋白分子具有两性性质,且有一定的导 向性,κ-酪蛋白分子糖基化的末端由胶团向外伸出,形成亲水性外壳,而疏水的 末端朝向胶团内部,与内部酪蛋白形成疏水相互作用;③κ-酪蛋白与αs1-酪蛋白 和αs2-酪蛋白不同,它和αs2-酪蛋白包含2个半胧氨酸残基。因此,κ-酪蛋白能够在分子间形成二硫键,也可以使所有的胶团结构稳定。
2.金属离子对稳定性的影响:
金属离子可以改变胶团的疏水性、电动电势和热稳定性。金属离子(Fe2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+)、柠檬酸盐、无机磷酸盐,不同阳离子的加人使胶团疏水性和电动电势发生了不同变化,而对胶团直径并无影响。此外,Mg2+、Fe2+的加人,降低了酪蛋白胶团的热稳定性。
3.pH值和超声波功率也会影响酪蛋白胶团的稳定性
在高pH值、大功率超声波作用下,蛋白的稳定性大幅度下降,pH值与功率的相互作用有利于酪蛋白胶团结构疏松及粒子的分散性增强。研究表明:①pH值为2.0~3.0、6~12时,酪蛋白分子可自行组合形成胶团,pH值为3.0~5.5时发生聚沉(酪蛋白等电点值);② 疏水相互作用、氢键及静电作用在酪蛋白胶团形成中起着重要作用;③ 在低pH值2.0~3.0下,酪蛋白胶团结构紧密,此时为键与疏水相互作用发挥主要作用而在高pH值5.5~12下 ,带负电荷的酪蛋,白分子相互排斥致使胶团结构松弛,胶团半径随值的升高而增大 。
另外,研究还发现:①随着pH值的升高,酪蛋白胶团粒径增大,粘度系数增大;② 同等pH值下,超声波处理使得酪蛋白胶团粒径减小,粘度系数减小,且130kHz作用影响强于35kHz超声波;③35kHz超声波作用下,随着功率的增大,任何 pH值下溶液的混浊度与酪蛋白胶团粒径均减小。可见,在高pH值、 大功率超声波作用下下降的幅度更大,pH值与功率的相互作用有利于酪蛋白胶团结构疏松及粒子的分散性增强 。

酶解特性
研究表明,完整的酪蛋白没有ACE抑制活性,而其酶解产物则具有ACE抑制活性,说明这些小肽是隐藏于牛乳酪蛋白一级结构中的。通过酶的水解作用,这些具有特定结构的小肽得以释放出来。因此,酪蛋白的水解是十分重要的。
酪蛋白的水解主要发生在水解反应的前+3.0内,之后,随着时间的延长,并不能显著提高其水解度;增加水解用酶的量,可以略微提高酪蛋白的水解度,但增幅不大,但酶量的增加,可以较大地提高反应初期的水解度;当E/S为1:10时,水解产物具有最大的ACE酶抑制活性,高达88%-90%,但是产生这一现象的原因尚不清楚;增加底物的量会降低反应体系的水解度,底物量越大,降幅越大。

制备方法
1.将牛奶脱脂,之后加酸如乳酸、乙酸盐酸等,调节pH= 4.6,使干酪微胶粒失去电荷,凝固沉淀,具体过程为:牛奶→脱脂奶→加酸(pH= 4.6)→沉淀。用此法制得者称为酸酪蛋白,白色至淡黄色粉末或颗粒。
2.利用粗制凝乳酶与牛奶作用,然后制成脱脂奶,最后得到沉淀。用此法制得者称为凝乳酶酪蛋白,白色粒状,无嗅无味。

酪蛋白中功能活性肽分类
在原始酪蛋白中含有很多无活性或活性很低的、且具有功能性的肽段,经过在机体内消化或体外酶解的方式可以被释放出来,具体包括:
1.抗高血压肽:血管紧张素I型转化酶是一种含锌的金属肽酶,这种金属肽酶参与合成高血压多肽、 血管紧张肽以及降解低血压、血管舒缓激肽。 因此,抑制剂具有抗高血压的效果。小鼠试验发现,酪蛋白经胃蛋白酶水解后,酶解产物具有ACE抑制活性,且分子量低于3000Da的短肽活性更强。对于已鉴定的具有ACE抑制活性的肽链,多见于αs1-酪蛋白、β-酪蛋白及κ-酪蛋白序列中。 如胰蛋白酶处理的酪蛋白水解物中,对应αs1-CN(f23-24)、αs1-CN(f23-27)、αs1-CN(f194-199)以及β-CN(f177-183)、β-CN(f193-202)具有ACE抑制活性。鉴于αs2- 酪蛋白的难溶性,难以分离纯化,对其序列中ACE抑制活性的报道较少。
2.酪蛋白磷酸肽(CPP):据报道,目αs1、αs2或β -酪蛋白在体外或体内经消化可得到CPP。αs1-酪蛋白的 f43-58、f45-55、f59-79、 f66-74和f106-119,αs2- ,酪蛋白的 f46-70、f55-75、f126-136和f138-149,β-酪蛋白的 f1-25、f1-28、f2-28等都已经被发现。大部分的CPP序列的共同点是2个谷氨酸残基排列在3个磷酸丝氨酸残基后面。CPP能够有效结合二价金属离子,增强矿物质元素的溶解性。另外,一系列试验结果表明: ①β-CPP与Fe的结合提高利用率,可以用于治疗幼鼠的铁缺乏症; ② Fe-β-CPP 与铁盐的吸收不同,它通过细胞吞噬作用被吸收;③ Fe-β-CPP抑制了CPP的去磷酸化作用及蛋白酶解作用,可以添加在强化食品当中。酪蛋白磷酸肽作用如下:
3.免疫活性肽:新生婴儿可以通过母乳喂养来获得抵抗细菌和病毒感染的能力,其中酪蛋白就是获得的免疫物质之一。事实上,在消化酶的作用下,这些具有免疫调节能力的肽被释放了出来 。
4.阿片样活性肽:阿片样活性肽包括阿片激动活性肽阿片拮抗活性肽,具有类似鸦片(吗啡)的药理特性,有调节睡眠模式、镇痛减压、调节呼吸和调节胃肠蠕动等作用。研究最 多的阿片样活性肽是 β-酪啡肽,是β-酪蛋白的片段 , 主要集中在第60和第70的残基之间,属,于激动活性肽。此外,阿片拮抗活性肽能够抑制脑啡肤的激动活性,多见于牛乳和人乳的κ-酪蛋白序列中。
5.酪蛋白抗氧化肽:是1类研究较广泛的生物活性肽,能够有效清除体内过多的自由基,增强人体的抗衰老和抗疾病的能力。抗氧化肽作为功能性食品或药品最终都要通过摄入体内发挥其功效,抗氧化肽经口服的方式摄入人体后,受到胃蛋白酶和肠道中各种蛋白酶的影响,可能使其中影响活性的关键结构,或氨基酸受到破坏或丢失,从而导致活性降低,即抗氧化肽活性在胃肠消化过程中,遭到破坏。此外,抗氧化肽还受到胃肠环境中多种因素的影响,如底物浓度、酶浓度、消化时间、胃液pH等。

用途
酪蛋白可用作食品增稠剂,营养强化剂、乳化剂和稳定剂;用于冰淇淋、饼干、面包、花味油膏、蛋黄酱、火腿、腊肠等;由于流动性好、易于涂装施工,还用作木材胶料、纸张涂料、糖尿病人食品、生物用料、纺织浆料、水溶性涂料的基料、塑料钮扣原料、粘合剂原料、医药及生化试剂等。

【主要参考资料】
http://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB8677929.htm
[1] 吕桂善等. 酪蛋白水解进程的研究. 食品工业科技.2003,8:24-27.
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[3] 安家驹主编;包文滁,王伯英,李顺平 合编.实用精细化工辞典.北京:中国轻工业出版社.
[4] 吴世敏,印德麟 主编.简明精细化工大辞典.沈阳:辽宁科学技术出版社.1999.
[5] 王翔朴,王营通,李珏声主编.卫生学大辞典.青岛:青岛出版社.2000.
[6] 刘珊珊等. 酪蛋白抗氧化肽的胃肠消化稳定性研究.中国食品学报. 2014, 14 (2):47-53

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