羟基积雪草酸是积雪草中有效活性成分，研究表明其具有抗氧化、抗抑郁、抗菌、调节免疫等多种药理活性功能，尤其是对肿瘤细胞具有显著的抑制作用。
羟基积雪草酸的提取及测定-上禾生物
提取【1】
1. 将积雪草粉碎,用60-70v%乙醇溶液川流提取,将提取液过滤,滤液回收溶剂，再加40-50C水溶解,过滤,将滤渣溶于50-60v%乙醇溶液,得到粗提液。
2. 将粗提液上XAD-9人孔树脂柱,用pH值为2-4的酸液洗脱,合并流川液和酸洗液。
3. 调节合并液pH值至中性,过滤,将滤液再次EXAD-3大孔树脂柱,用体积浓度为30-40%的乙醇洗脱,薄层层析跟踪检测,收集含有积雪草酸成分的乙醇洗脱液;再刃体积浓，度为55-65%的乙醇洗脱，薄层，层析跟踪检测,收集含羟基积雪草酸的乙醇洗脱液,将羟基积雪草酸洗脱液回收乙醇,干燥,得到羟基积雪草酸。
步骤1中，体积浓度为60-70%的乙醇可充分溶解积雪草中的二萜类物质，包括三萜炎皂节和三萜酸炎物质。由于积雪草皂并的分子中往往结合有多数糖分子,羟基数日多,能表现出一定的亲水性，但足亲水性不强,微溶于水中，而二萜酸类极性较小，不能溶于水中。因此采用40-50℃温水可帮助积雪草总皂节溶解,积雪卓三惦酸类物质不溶于热水中，将滤液过滤,取滤渣溶于乙醇，达到去除积雪草总皂苷的日的。
XAD-9树脂主耍吸附的是脂溶性成分，大分子极性強的物质，这些物质对树脂的吸附性更强，大孔树脂优先吸附这些物质而很快达到饱和。XAD-9是极性大孔树脂，与三萜酸类极性相差较大，无法有效吸附三萜酸类化合物，XAD-9树脂平均孔径较大，远远大于三萜酸类化合物，也无法起到物理截留三萜酸类化合物的作用，因此，三萜酸类化合物会随着流出液流出。pH值为2-4的酸液洗脱可进一步将树脂中吸附的少量三萜酸类化合物洗脱下来,避免三萜酸类化合物的吸附损失。
步骤2中,粗提液上柱速度为3-5BV/h。酸液的洗脱速度为1-2BV/h。
步骤3中，XAD-3型号大孔树脂为非极性树脂，平均孔径为0.44um，比表面积256m2/g。该树脂对三萜酸类化合物有很有的吸附性能，滤液的上柱速度为0.5-1BV/h,可将二帖酸炎化合物吸附完全。由于积雪草酸和羟基积雪草酸存在极性差异，采用体积浓度为30-40%的乙醇洗脱，可优先洗脱积雪草酸。然后用体积浓度为55-65%的乙醇洗脱，可将剩下的羟基积雪草酸洗脱卜来。
与现有技术相比,本方法针对目标成分进行吸附和解吸附，提取的羟基积雪草酸收率高达90%以上，纯度高达95.0%以上。
具体实施
1. 将积雪草粉碎，用60v%乙醇溶液回流提取,60v%乙醇的用量为积雪草重量的5倍，在40°C下回流提取1次，每次0.5h，将提取液过滤,滤液回收溶剂，再加40°C水溶解，过滤，将滤渣溶于50v%乙醇溶液，得到粗提液。
2. 将粗提液上XAD-9大孔树脂柱,粗提液上柱速度为3BV/h，用pH值为2的酸液洗脱，酸液的洗脱速度为1BV/h，合并流出液和酸洗液。
3. 调节合并液pH值至中性，过滤，将滤液再次上XAD-3大孔树脂柱，滤液的上柱速度为为0.5BV/h，用体积浓度为30%的乙醇洗脱，乙醇洗脱述度为2BV/h，薄层层析跟踪检测，收集含有积雪草酸成分的乙醇洗脱液。再用体积浓度为55%的乙醇洗脱，乙醇洗脱速度为2BV/h薄层层析跟踪检测，收集含羟基积雪草酸的乙醇洗脱液，将羟基积雪草酸洗脱液回收乙醇，干燥，得到羟基积雪草酸。
经HLPC分析,羟基积雪草酸的回收率为90.08%以上,纯度高达95.27%。
测定积雪草总苷元中的羟基积雪草酸【1】
采用高效液相色谱法(HPLC)对积雪草中的活性物质进行分离检测研究，但羟基积雪草酸和terminolic acid 在一般的HPLC条件下，无论以恒比例洗脱或梯度洗脱均显示单一的色谱峰，无法得到理想的分离度。采用β-环糊精(β-CD)为流动相添加剂对它们进行了分离，并对分离后的物质进行了简单的确证。考察了不同浓度的β-环糊精和不同流动相pH对其分离度的影响，建立了积雪草样品中羟基积雪草酸含最的测定方法。
供试品溶液的制备
精密称取50%积雪草总苷元适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成50%积雪草总苷元甲醇溶液5.58 g/L 备用。进样前用0.45 um微孔滤膜过滤。
羟基积雪草酸和terminolic acid的收集
将50%积雪草总苷元溶液重复进样，在HPLC检测器的出口处分段收集羟基积雪草酸和terminolic acid各约40 mL。将收集到的洗脱液蒸干后，利用β-环糊精在甲醇中溶解度小而羟基积雪草酸和terminolic acid在甲醇中溶解度大的差异，去除β-环糊精,进样，进行LC-MSD检测，对收集的两种物质进行简单的确证。
羟基积雪草酸的定量分析
精密称取羟基积雪草酸对照品10.0 mg，用甲醇配制成10.0g/L的溶液，然后用甲醇进行倍比稀释，配成质量浓度依次为5.0，2.0，1.0，0.5和0.1g/L的羟基积雪草酸对照品甲醇溶液。以峰面积(y)对质量浓度(x, g/L)进行线性回归,羟基积雪草酸的回归方程为y = 116.54x一10. 058，r2=0.9989。结果表明,样品量在0.1-5.0 g/L范围内浓度与峰面积呈线性关系。
精密配制羟基积雪草酸对照品0.5,1.0,2.0g/L3种浓度的甲醇溶液，每种浓度重复进样3次，连续测定5 d,其峰面积的日间精密度和日内精密度(以相对标准偏差( RSD)值计)均小于2. 0%。
精密量取供试品溶液,按照前面的色谱条件,重复进样3次,按回归方程计算供试品的含量,结果表明:50%积雪草总苷元中羟基积雪草酸的平均质量分数为18. 1%。
参考文献
[1]潘见，开桂青，袁传勋，周蓓蓓，金日生，袁 媛，β一环糊精流动相添加剂法分离测定积雪草 总苷元中的羟基积雪草酸，色 谱 Chinese Journal of Chromatography，2007.05