糜蛋白酶(Chymotrypsin)试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
糜蛋白酶,又称胰凝乳蛋白酶,是胰腺分泌的一种蛋白水解酶,能迅速分解变性蛋白质。糜蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似,但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上糜蛋白酶用于痰液稀化,对脓性和非脓性痰液均有效;也用于创伤或手术后伤口愈合,如白内障摘除。
糜蛋白酶(Chymotrypsin)试剂盒测定原理:
糜蛋白酶催化ATEE水解,产物在237 nm有特征光吸收;通过测定237 nm 光吸收增加速率,来计算糜蛋白酶活性。
自备仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入50 mL蒸馏水充分溶解。
粗酶液提取:
组织样品:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心10min,取上清,即粗酶液。
糜蛋白酶(Chymotrypsin)试剂盒测定步骤:
1. 分光光度计预热30min,调节波长到237 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中保温30min。
3. 空白管:取1mL石英比色皿,加入100μL试剂一,1000μL试剂二,混匀于237nm测定4min内吸光值变化,记为△A空白管。(从吸光值稳定增加开始计时)
4. 测定管:取1mL石英比色皿,加入100μL粗酶液,1000μL试剂二,混匀于237nm测定4min内吸光值变化,记为△A测定管。(从吸光值稳定增加开始计时)
注意:空白管只需要测定一次。
糜蛋白酶活性计算公式:
(1)按照蛋白浓度计算
活性单位定义:25℃每毫克蛋白每分钟催化吸光值增加1为一个酶活单位。
糜蛋白酶(U/mg prot)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总÷(Cpr×V1)÷T
=2.75×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),100μL=0.1 mL;V反总:反应总体积,1100μL=1.1mL;T:反应时间(min),4min。
(2)按照样本质量计算
活性单位定义:25℃每克样品每分钟催化吸光值增加1为一个酶活单位。
糜蛋白酶(U/g鲜重)=(△A测定管-△A空白管) ×V反总÷(W×V1÷V2)÷T
=2.75×(△A测定管-△A空白管)÷W
W:样品质量(g);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),100μL=0.1 mL;V2:粗酶液总体积(mL),1 mL;V反总:反应总体积,1100μL=1.1mL;T:反应时间(min),4min。
糜蛋白酶(Chymotrypsin)试剂盒注意事项:
临用前配制的试剂配置好后3天内使用完毕。
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