亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意： 正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）试剂盒测定意义：
硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。
测定原理：
亚硝酸还原酶可将NO2—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2—减少，即540nm处吸光值的变化可反应亚硝酸还原酶的活性。
需自备的仪器和用品：
天平、研钵、可见分光光度计、水浴锅、低温离心机、1mL玻璃比色皿。
试剂的组成和配制：
提取液：液体80mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加12mL蒸馏水溶解。
试剂三：液体12mL×1瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）
试剂四：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）
试剂五：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。
工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。
酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2．细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。
亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）试剂盒测定操作表：
| 空白管 | 对照管 | 测定管 |
样本（μL） |
| 100 | 100 |
蒸馏水（μL） | 100 | 200 |
|
试剂一（μL） | 200 |
| 200 |
试剂二（μL） | 200 | 200 | 200 |
混匀后，25℃反应1h |
试剂三（μL） | 200 | 200 | 200 |
充分震荡30S |
上清液（μL） | 350 | 350 | 350 |
工作液（μL） | 700 | 700 | 700 |
充分混匀，蒸馏水调零，静置3min后测定540nm处吸光值，分别记为A空白管、A对照管、A测定管。空白管只要做一管，每个测定管需设一个对照管。 |
计算公式：
标准曲线：y = 1.3594x + 0.0072，R2 = 0.9997；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A标准管-A空白管）。
1．按照蛋白含量计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（V样×Cpr）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h/g 鲜重）=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（W ×V样÷V样总）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷W
3. 按照细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细胞每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h /104 cell）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷细胞数量
V标：标准液体积，0.2mL；V样：体系中加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g
注意事项：
1. 配制好的工作液3天内使用完。
2. 若吸光值超过3，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。
3. 严格控制显色时间，否则会对结果有影响。
4. 标准曲线线性范围为0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。
5. A空白管-（A测定管-A对照管）线性范围为0.02-3。
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