蛋白酶K的应用主要为核酸提取时去除DNA酶和RNA酶，并且可将结合于基因组上的组蛋白去除，还可用于碱性磷酸酶的失活。目前分子生物学技术已应用于许多检测标准中，例如转基因检测、动物属性检测、致病微生物检测等。在分子生物学检测中核酸的提取质量直接影响了后续PCR反应的扩增效率。许多标准在核酸提取步骤中都设立了添加蛋白酶K消化的步骤，以期提取较纯的核酸。为了保护核酸，分子生物学核酸提取实验中通常含有EDTA等试剂，由于EDTA可以与金属离子络合，因此可能会导致酶活性受到影响；并且通常为pH8.0时和55℃条件下进行消化，不同pH值和温度条件会使得酶活性受到影响。
分离DNA和RNA期间使核苷酸酶蛋白失活。去除内毒素对阳离子蛋白的约束，如溶菌酶和核糖核酸酶。研究报告显示用于分离肝，酵母，绿豆线粒体测定细胞膜上的酶用于抗体标记，石蜡包埋组织切片中暴露抗原结合位点。消化脑组织样本中的蛋白质，用于朊病毒的传染性海绵状脑病（TSE）的研究
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