T 细胞无血清培养基（有酚红/无酚红）
一、产品基本信息
产品名称 | Applied Cell® T 细胞无血清培养基（有酚红/无酚红） |
货 号 | AC-1001035/AC-1001035PRF |
规 格 | 1000mL（Without IL-2） |
保存条件 | 2-8℃保存，打开包装后，2-3 周内使用完毕 |
保质期 | 12 个月 |
二、产品简介
T 细胞无血清培养基是埃泽思生物（Applied Cell®）一款用于人体外周血来源 T 细胞扩增的无血清培养基。外周血 T 淋巴细胞的扩增培养是一项重要的免疫学研究和临床应用技术，扩增和活化血液淋巴细胞T 细胞可用于癌症患者的免疫治疗。本产品无动物源成分，未添加IL-2 等细胞因子，具体使用方法如下所示。
三、材料
• 重组人白细胞介素 2/IL-2 GMP Grade(Applied Cell®: AC-1001100)
• 抗人 CD3 单克隆抗体(OKT3)/ CD3 单克隆抗体(Applied Cell®: AC-1001101)
•磷酸盐缓冲液（Applied Cell®: AC-1001037）
• 淋巴细胞分离液（Applied Cell®: AC-1001030）
•热灭活的自体人血清或血浆，通过离心自体血液制备
• 细胞培养瓶
•一次性注射器（50mL）
• 生理盐水
四、操作方法(以下步骤皆应在无菌条件下操作)
4-1 包被培养瓶
1) 向细胞培养瓶中加入 10-15mL 抗 CD3 抗体(CD3 单克隆抗体/抗人 CD3 抗体)溶液(用磷酸盐缓冲液稀释至 5mg/mL)。
2) 轻轻摇动烧瓶，将抗体溶液涂在整个表面。
3) 在室温下放置 1 小时或在冰箱中放置过夜。
4) 吸出并移除溶液，然后用 10 mL 缓冲液清洗 1 次。
5) 处理过的培养瓶应立即使用或储存在冰箱中不超过一周时间。
*通过这种处理，培养瓶的表面变成亲水性的，并且液体容易在表面上散布。
4-2 淋巴细胞和血浆的收集
1) 外周血淋巴细胞制备：使用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法从 25ml 肝素化的外周血中分离外周血淋巴细胞。
2) 用移液管收集上层血浆，倒入灭菌试管中，用于制备自体热灭活血浆。
3) 小心地将中间白细胞层收集到离心管中，并用缓冲液稀释 3 倍以上，并用于 4-4 步骤使用。
4-3 灭活血浆制备
1). 用移液管小心地将上层血浆收集到无菌离心管中。
2). 在 56℃下加热 30 分钟。
3). 在室温下 1,200xg 离心 10 分钟。
4). 用移液管将上清血浆收集到无菌容器中，并储存在-20--80℃保存。
4-4 外周血单核细胞(PBMC)制备
1). 使用移液管将第二层的单核细胞收集到无菌离心容器中。
2). 用缓冲液稀释 2 倍以上，在室温，500G 离心 5 分钟，沉淀细胞。
3). 吸掉上清液。
4). 用缓冲液洗涤细胞，并通过以 500xg 离心 5 分钟沉淀细胞。
5). 去除上清液。
4-5 T 淋巴细胞的初始培养 （day0-day3-day5）
1). 用含有 700 IU/ml IL-2 和 10%热灭活血浆的 50mL ACM-T 培养基以约 1x106 细胞/ml 的细胞密度重悬 PBMC。
2). 将细胞悬浮液接种到包被好的培养瓶中(50mL/T-225 培养瓶)。
3). 在 37℃的 5% CO2 培养箱中培养 3 天。
4). 培养 3 天后，在培养瓶中加入 50ml 含 700IU/mL IL-2 的 ACM-T Medium，继续培养。
5). 培养 2 天后，扩增至 3 个培养瓶，并在每个培养瓶中补充加入 70ml ACM-T Medium(添加 700 IU/ml IL-2，无需添加血浆)。
4-6 培养袋扩增培养 (day5-day8-day12)
1). 在培养后 3 天后，将以上 3 瓶细胞悬液收集，并转移到 1 个细胞培养袋中，同时需加入额外加入
700 -1000mLACM-T Medium（添加 175 IU/mL IL-2，无需添加血浆）。
2). 在培养 4 天后，将以上细胞平均分配到 2 个培养袋中，并向每个袋中加入 500mL ACM-T Medium (添加 175 IU/mL IL-2，无需添加血浆)。
3). 根据培养计划，在相同条件下继续培养，直到达到期望的细胞数。
4-7 细胞收获
1). 在培养后的第 14 至 21 天，将所有细胞悬液收集到无菌离心瓶中，并以 500xg 离心 10 分钟。
2). 用含有 0.1%白蛋白的生理盐水或缓冲液洗涤细胞 1-2 次，洗涤后 500xg 离心 10 分钟收集细胞，。
3). 用含有 1%人血清白蛋白的注射溶液或生理盐水重新悬浮细胞，计数。
五、培养时间流程表
天数 | 培养瓶/细胞培养袋 | 培养瓶/细胞培养袋 | ACM-T 培养基添加量(mL) | IL-2 单位：IU/mL | 自体血浆添加量 (mL) | 对应流程 |
Day1 | T-225 | 1 | -- | -- | NO | 4-1 |
Day 0 | T-225 | 1 | 50mL | 700 | 5ml | 4-2/4-3/4-4/4-5 |
Day 3 | T-225 | 1 | 50mL | 700 | NO | 4-5 |
Day 5 | T-225 | 3 | 70mL x 3 | 700 | NO | 4-5 |
Day 8 | 培养袋 | 1 | 1000 mL | 175 | NO | 4-6 |
Day 12 | 培养袋 | 2 | 1000 mL | 175 | NO | 4-6 |
Day14 | 培养袋 | 2 |
|
| NO | 4-7 |
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