蛋白互作GST Pull-Down试剂盒

品名：Smart-GST™ GST Pull-Down Kit，货号：IF9604，品牌：Engibody

订购及技术咨询：朱小鸥，13817407320(微信同号)

NIH、麻省理工、哈佛、斯坦福等世界名校课题组青睐并长期采购的GST Pull-Down试剂盒！

Smart-GST™蛋白互作GST Pull-Down试剂盒

Smart-GST™ GST Pull-Down试剂盒的四大优势
 
1、本试剂盒适用于细胞蛋白体外互作、组织蛋白体外互作、纯化重组蛋白体外互作以及这三类蛋白之间互作的研究。
 
2、本试剂盒用于验证两个已知蛋白的相互作用，也可以用于筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
 
3、本试剂盒完美衔接下游实验（Western Blotting、MS质谱）。
 
4、本实验手册是一本GST Pull-down实验的全面技术手册，透彻分析了GST Pull-down实验中的重点、难点，对各种重点难点问题都有针对性的解决方案。同时包含了蛋白互作研究的基础知识和经典数据库信息，有了这本保姆级使用手册，所有疑难都会迎刃而解，GST Pull-down尽在掌握之中。



第一部分：背景简介及应用场景

GST pull down是将已知蛋白与GST融合，而该融合蛋白通过GST标签与谷胱甘肽GSH磁珠亲和结合。简单来说，我们假定X蛋白和Y蛋白可能存在互作，将纯化的融合GST的X蛋白和纯化的Y蛋白以及能特异性结合GST的谷胱甘肽GSH磁珠混合在一起孵育一定时间，然后洗去未结合的蛋白，并洗脱诱饵蛋白X及猎物蛋白Y，随后进行SDS-PAGE电泳。通过Western Blot检测结果，可以看到GST-X蛋白和Y蛋白所对应的条带，即表明了X蛋白和Y蛋白因发生相互作用而被GST-X pull down。
 
备注：可以在下游衔接Western Blot、MS质谱等实验。其中Western Blot用于验证已知的互作蛋白，MS质谱用于筛选发现未知的互作蛋白。
 
1、GST Pull-down和CoIP，这两种最经典蛋白-蛋白互作技术的区别是什么？
1)、GST Pull-down———GST 标签融合蛋白与猎物蛋白pull-down，In Vitro体外研究蛋白互作PPI的经典方法。将目的蛋白序列加上GST或His标签序列进行基因合成并构建重组质粒，转化大肠杆菌后表达纯化蛋白，再将GST 标签融合蛋白固定于GSH磁珠上作为诱饵蛋白，然后去拉取与之结合的猎物蛋白。
 
2)、CoIP———蛋白免疫共沉淀，In Vivo体内研究蛋白互作PPI的经典方法，保留在靶标细胞/组织内的天然构象蛋白互作的真实情况，可以用于验证已知蛋白也可以用于筛选发现未知蛋白。
 
2、在下列两种情况下GST Pull-down是不可替代和不可或缺的：
1)、诱饵蛋白找不到CoIP级的抗体，而GST Pull-down不需要CoIP级的免疫捕获抗体，正好克服了这个难题。
 
2)、目的蛋白所在的研究对象（比如真菌等）无法采用普通的标签质粒转染、转化的方法进行外源标签融合蛋白的过表达，也找不到内源蛋白的抗体，这时便无法实施CoIP实验，因此GST Pull-down就是这类情况下研究蛋白互作的唯一选择。
 
3、GST Pull-down的优点
1)、鉴定的蛋白是直接作用的蛋白，而不是间接作用的多个猎物蛋白复合物；
2)、GST标签蛋白可把一些难溶蛋白提高溶解度变成可溶性蛋白，使实验变得具有可行性；
3)、GSH谷胱甘肽偶联磁珠亲和力强，洗脱纯度高，且是非变性、温和、竞争性洗脱。
 
4、GST Pull-down的缺点
1）、验证互作是在离心管中进行的体外反应，不能够完全反映细胞内蛋白真实互作的生理状态；
2）、融合表达的GST标签，肽链较长，大到26kD，可能会改变目的蛋白的天然构象。
 
 
第二部分：技术原理和技术流程
技术原理：
 
基本原理是将靶蛋白与GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）的融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽（GSH）标记的磁珠上,作为与目的蛋白结合捕获的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液与之孵育,可从中捕获与之相互作用的“猎物蛋白”(目的蛋白), 洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳，随后可以进行下游的WB检测或者质谱分析, 从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“猎物蛋白”均可来自于细胞裂解物、组织裂解物或纯化的重组蛋白（重组蛋白可以通过大肠杆菌等表达系统或者体外转录翻译系统获得）。此方法简单易行, 操作方便。
 
技术流程：
 


第四部分：实验结果与示例展示
 
GST Pull down实验仅仅是从样本中捕获富集特定目的蛋白的过程，必须衔接下游实验才能得出有价值的结果。最常见的下游实验是WB实验：
 
Western blotting (WB，或称为IB)
用于两个已知蛋白互作验证（In Vitro体外实验）
 
 

第五部分：GST Pull Down试剂盒组分清单
（共计10个组分，均可单独购买）
 

订购及技术咨询：朱小鸥，13817407320(微信同号)