辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒（微量法100T/48S） 新品

辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书

                                                   微量法 100管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。

自备仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

NAD+和NADH的提取：

1、 血清（浆）中NAD+和NADH的提取

NAD+的提取：按照血清（浆）体积（ml）：酸性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1ml血清（浆），加入1ml酸性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADH的提取：按照血清（浆）体积（ml）：碱性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1ml血清（浆），加入1ml碱性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织中NAD+和NADH的提取：

NAD+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1ml酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADH的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1ml碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、 细胞或细菌中NAD+和NADH的提取：

NAD+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：酸性提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADH的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：碱性提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。