NETs Elisa kit / 人中性粒细胞胞外诱捕网络检测试剂盒使用广泛

NETs Elisa kit / 人中性粒细胞胞外诱捕网络检测试剂盒使用广泛  

简介    

中性粒细胞胞外诱捕网络(NETs)是细胞外纤维的网络，主要由中性粒细胞的DNA组成，它与病原体结合，中性粒细胞是免疫系统对抗感染的第一道防线，NETs使中性粒细胞能够杀死细胞外病原体，同时最大限度地减少对宿主细胞的损害，在体外用药理学制剂乙酸苯丙醇酯（PMA）、白细胞介素8（IL-8） 或脂多糖（LPS）激活后，中性粒细胞释放颗粒蛋白和染色质，通过一个主动过程形成称为NET的细胞外纤维基质，NETs在炎症部位大量产生，并在局部提供高浓度的抗菌分子，捕获并杀死各种病原体，快速控制病菌在体内感染，起到免疫抗菌，NETs通过局部提供高浓度的抗菌蛋白来消灭多种病原体，既能捕杀革兰氏阳性菌（如A组链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌）和革兰氏阴性菌（如沙门氏菌和志贺氏菌），也能捕杀真菌（如白色念珠菌）。

本试剂盒人NETs免疫测定是一种三步法固相夹心ELISA，用于测量细胞培养上清液、血清和血浆中的人NETs。试剂盒包含大肠杆菌表达重组人NETs和针对重组蛋白产生的抗体。使用天然人NETs获得的结果显示出与使用重组标准品获得的标准曲线平行的线性曲线。这些结果表明，该试剂盒可用于测定天然人NETs的相对质量值。
检测原理

试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术：将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物NETs，孵育清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色液后，若样本中有待测物则显蓝色，则加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中NETs的浓度。

操作要点

1. 混合蛋白质溶液时，应始终避免起泡。为了避免交叉污染，在添加每个标准品、样品和试剂时应更换移液器枪头。此外，每种试剂应单独使用容器。

2. 确保试剂不间断地添加到板孔中。为了确保准确的结果，在孵育步骤中需要粘合好封板膜。

3. 当使用自动洗板机时，在加入洗涤缓冲液后加入30秒的浸泡期，或者在洗涤步骤之间将板旋转180度，可以提高测定精度。

4. 显色剂应保持无色，直到添加到板中。确保显色剂不受光线照射。显色剂应从无色变为蓝色。

5. 应按照与显色剂相同的顺序将终止液添加到板中。加入终止液后，孔中形成的颜色将从蓝色变为黄色。绿色的孔表示终止液未与基质溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；

2. 移液器及枪头；

3. 蒸馏水或去离子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；

6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀释标准品和样品的试管。

注意事项

1. 本试剂盒提供的终止液为稀硫酸溶液，具有一定腐蚀性，应谨慎操作。

2. 本试剂盒中的某些成分含有防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾。

3. 显色剂B可能会引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾。

4. 佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护用品，处理后彻底洗手。

试剂准备

1. 使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。

2. 洗涤液/稀释液配置：如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1: 20稀释（例如：1mL浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）

标准品配置：

试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从800ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至40ng/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的40ng/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将40ng/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为：40ng/mL、 20ng/mL、 10ng/mL、 5ng/mL、 2.5ng/mL、 1.25ng/mL、0.625ng/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ng/mL)。

抗体工作液配置:

使用前10分钟，用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×生物素化抗体工作液，根据所需用量配置。

酶结合物工作液配置 :

使用前10分钟，用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。

备 注：如待测样本中NETs浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数 (建议：将待测样本用样品稀释液最低稀释1倍，在正式实验之前做预实验，以确定具体稀释倍数) ；标准品母液、100×生物素化抗体溶液及100×SA-HRP溶液请根据实验所需酶标板孔数吸取一定量配置工作液，剩余溶液应放回2-8℃储存。

结果的计算

计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线（作图时去掉空白组的值）或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

示例数据

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。

本图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果

灵敏度

经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.31ng/mL。

特异性

该试剂盒测定可识别天然和重组人NETs。

其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。