三棱探针法PCR鉴定试剂盒

检测原理

基于TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术：

探针设计：针对三棱基因保守区域设计特异性引物及探针，探针5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团。

信号释放：PCR扩增时，Taq酶切割探针，分离报告基团与淬灭基团，释放荧光信号。

定量分析：通过实时监测荧光强度（FAM通道），计算Ct值，实现靶序列的定性与定量检测。

试剂盒组成

| 成分 | 规格/数量 |

| qPCR反应缓冲液 | 500 μL |

| 酶预混液 | 100 μL |

| 三棱特异性引物混合液 | 100 μL |

| TaqMan探针 | 50 μL |

| 阳性对照（1×10⁸拷贝/μL） | 50 μL |

| 阴性对照（无核酸酶水） | 50 μL |

| 荧光专用模板稀释液 | 1 mL |

操作步骤

1. 标准曲线制备（6个梯度稀释，10²~10⁷拷贝/μL）：

使用阳性对照按10倍梯度稀释，避免交叉污染。

2. 样本处理：

RNA/DNA提取：推荐使用柱式提取试剂盒，提取后模板保存于-20℃。

对照设置：每批次需包含阳性对照（稀释后模板）和阴性对照（水）。

3. PCR反应体系（20 μL）：

| 成分 | 体积（μL） |

| qPCR缓冲液 | 10 |

| 酶混合液 | 2 |

| 引物混合液 | 2 |

| 探针 | 1 |

| 模板DNA/RNA | 5 |

4. 扩增程序：

逆转录（若需）：50℃ 30 min（仅RT-qPCR）。

预变性：94℃ 10 min。

扩增循环（40次）：94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集荧光信号）。

结果判读

定量分析：以标准曲线log值为横轴，Ct值为纵轴，计算样本浓度。

定性分析：

阳性：Ct ≤ 35，扩增曲线呈典型S型。

阴性：Ct ≥ 40或无扩增。

灰区（35<Ct<40）：需复测确认。

注意事项

分装试剂避免反复冻融（≤7次）。

操作分区（样本处理、试剂配制、扩增）以防止污染。

不同批号试剂不可混用。

阳性对照需最后加入，避免气溶胶污染。

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