欧洲放线菌探针法荧光定量PCR试剂盒
商品属性
产品名称 | 欧洲放线菌探针法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Actinomyces europaeus Probe-based Real-time PCR Kit |
规格 | 50T | 货号 | PR5288 |
检测原理
采用TaqMan探针法，探针5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性切割探针，释放荧光信号，荧光强度与扩增产物量成正比，实现定量检测。
产品特点
高灵敏度：优化引物与探针，检测限低至10²拷贝/μL。
高特异性：针对Actinomyces europaeus保守序列设计，无交叉反应。
即开即用：预混反应液（含酶、dNTPs、缓冲液等），仅需添加模板DNA。
内控对照：提供无传染性的DN段作为阳性对照，避免假阴性。
适用范围：科研用途，适用于血清、血浆、组织匀浆、细菌培养物等样本。
操作流程
样本制备
DNA提取：
血清/血浆：3000 rpm离心10-30分钟，避免反复冻融。
组织匀浆：生理盐水匀浆后离心取上清。
细菌样本：推荐使用柱式DNA提取试剂盒。
DNA保存：分装后-20℃冻存，避免反复冻融。
标准曲线制备（以10²~10⁷拷贝/μL梯度为例）
标记6管，分别加入45 μL稀释液（DEPC-H₂O或专用缓冲液）。
取5 μL阳性对照（10⁸拷贝/μL）加入第1管，梯度稀释至10⁷~10²拷贝/μL，每步震荡混匀。
各浓度取5 μL进行qPCR，每个梯度重复3次。
qPCR反应体系
| 组分 | 体积（μL） |
| 预混Master Mix | 10 |
| 引物/探针混合液 | 2 |
| 模板DNA | 5 |
| DEPC-H₂O | 至20 |
反应条件
预变性：95℃ 5分钟
循环：95℃ 15秒 → 60℃ 1分钟（45循环，荧光采集）
注意事项
分区操作：样本制备、试剂配制、扩增需在独立区域进行，避免污染。
阳性对照处理：稀释需在专用区域完成，严禁接触其他组分。
数据判读：Ct值＞35需重复检测，标准曲线R²≥0.98方有效。
仪器校准：定期校验荧光通道灵敏度。
质量控制
阴性对照：DEPC-H₂O替代模板，应无扩增曲线。
重复性：同一样本Ct值变异系数（CV）＜5%。
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