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品牌：MedChemExpress (MCE)
货号：HY-K0210
中文名称：His标签纯化凝胶珠（Ni-NTA）
存储条件：4°C，2年请勿干燥或冷冻琼脂糖珠。
产品活性：MCE His标签纯化凝胶珠 (Ni-NTA) 以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质，可实现高产量，高纯度的 His 标记蛋白的纯化。
生物活性：MCE His标签纯化凝胶珠 (Ni-NTA) 以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸 (NTA)，螯合镍离子 (Ni2+) 后，可以形成非常稳定的八面体结构，更加稳定、高效。 本产品可以用于纯化细菌、哺乳动物细胞、昆虫及杆状病毒等表达的 His 标签重组蛋白。 本产品的规格与实际凝胶体积一致，凝胶含量为 50%。
描述及优势：
MCE His标签纯化凝胶珠 (Ni-NTA) 以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸 (NTA)，螯合镍离子 (Ni2+) 后，可以形成非常稳定的八面体结构，更加稳定、高效。
本产品可以用于纯化细菌、哺乳动物细胞、昆虫及杆状病毒等表达的 His 标签重组蛋白。
本产品的规格与实际凝胶体积一致，凝胶含量为 50%。
操作流程：1. Buffer 的准备Lysis Buffer，Wash Buffer，Elution Buffer。注：根据不同的样品选择合适的 Buffer，也可根据自己的使用习惯配制不同的缓冲液体系，基本原则是“低咪唑上样，高咪唑洗脱”，或者“高 pH 上样，低 pH 洗脱”。Buffer 在使用前用 0.22 μm 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。 2. 样品处理细菌或酵母表达的蛋白1) 挑取单菌落到培养基，根据载体使用说明加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。2) 表达结束后，收集菌液至离心管中，7000 rpm，离心 15 分钟，弃上清，收集菌体沉淀。随后加入 1/10 体积的 Lysis Buffer 和蛋白酶抑制剂。加入溶菌酶 (工作液浓度为 0.2-0.4 mg/mL；如果表达的宿主细胞内含 pLysS 或 pLysE，可以不加溶菌酶)，需确认加入的蛋白酶抑制剂不会影响目的蛋白与 Agarose 的结合。3) 将菌体沉淀重悬混匀 (如果菌液浓度高，也可选择加入 10 μg/mL RNase A 和 5 μg/mL DNase I)，放置在冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。4) 将澄清的破碎液转移至离心管中，10000 rpm，4℃ 离心 20-30 分钟。取上清，置于冰上备用或 -20℃ 保存。酵母、昆虫和哺乳动物分泌表达可溶性蛋白1) 将细胞培养液收集至离心管中，5000 rpm，离心 10 分钟，取上清，弃沉淀，如上清中不含 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，可直接加入柱子进行后续操作；如含有 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需用 1×PBS 在 4℃ 条件下经透析后才能加入柱子。2) 对于大量体积的上清，需加入硫酸铵沉淀浓缩后，用 1×PBS 在 4℃ 条件下经透析后才能加入柱子。包涵体蛋白 (变性条件)1) 将培养液收集至离心管中，7000 rpm，离心 15 分钟，弃上清，收集菌体沉淀。2) 按照菌体: Lysis Buffer=1:10 (W/V) 的比例将菌体重悬混匀，冰浴超声破碎。3) 将破碎液转移至离心管中，10000 rpm，4℃ 离心 20-30 分钟。弃上清，重复步骤 (2) 和步骤 (3) 一次。4) 按照菌体: Lysis Buffer (含 8 M 尿素)=1:10 (W/V) 的比例将包涵体悬浮起来。5) 变性条件下进行His标签重组蛋白纯化操作。3. Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 的装填1) 用去离子水冲洗柱底筛板，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出 1-2 cm 的去离子水。2) 将 Agarose 悬浮混匀，小心地将浆液连续地倒入柱管中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。3) 打开柱底部出口，最初让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，得到很好的装填效果。当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上 3 倍柱体积的去离子水。标记柱床高度。4) 关闭柱底部出口。4. 样品纯化1) 平衡：使用至少 5 倍柱体积的 Lysis Buffer 平衡层析柱。2) 上样：利用泵或注射器上样。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或使用滤膜 (0.22 μm 或 0.45 μm)过滤。3) 洗杂：用 Wash Buffer 冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线 (一般至少 10-15 倍柱体积)，收集流出组分和洗杂部分。注：在平衡缓冲液加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。 4) 洗脱：用 Elution Buffer 采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常 5 倍柱体积洗脱液就足够了；线性梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如 20 倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。5) SDS-PAGE 检测：将纯化得到的样品 (包括流出组分、洗杂部分和洗脱部分)以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。
详情参考：www.medchemexpress.cn/inhibitor-kit/ni-nta-his-tag-purification-agarose.html
品牌介绍:• MCE (MedChemExpress) 拥有200 多种全球独家化合物库，我们致力于为全球科研客户提供前沿最全的高品质小分子活性化合物；• 50,000 多种高选择性抑制剂、激动剂涉及各热门信号通路及疾病领域；• 产品种类涵盖各种重组蛋白，多肽，常用试剂盒 ，更有 PROTAC、ADC 等特色产品，广泛应用于新药研发、生命科学等科研项目；• 提供虚拟筛选，离子通道筛选，代谢组学分析检测分析，药物筛选等专业技术服务；• 设有专业的实验中心和严格的质控、验证体系；• 提供 LC/MS、NMR、HPLC、手性分析、元素分析等各项质检报告，确保产品的高纯度、高品质；• 产品的生物活性多经各国客户实验验证；• Nature, Cell, Science 等多种顶级期刊及制药专利收录了MCE客户的科研成果；• 专业团队跟踪最新的制药及生命科学研究进展，为您提供全球最新的活性化合物；• 与世界各大制药公司及知名科研机构建立了长期的合作。
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