检测目标
靶基因：MBV的高度保守的p74基因（编码包涵体基质蛋白，毒力标志）。
覆盖毒株：亚洲主要流行株（如泰国株TH-2023、中国株CN-GD2025）。
检测限：10拷贝/μL，较传统病理学检测（需电镜观察）灵敏度提升100倍。
方法原理
一步法荧光RT-PCR：
FAM标记探针实时检测p74基因，内标（HEX标记对虾β-actin基因）监控提取质量。
采用抗抑制剂聚合酶，适配高盐/高有机物样本（如肝胰腺组织）。
适用样本
对虾组织：肝胰腺（病毒富集部位）、鳃、幼体（PL阶段）
环境样本：养殖水体（需0.22μm滤膜浓缩）
二、试剂盒组分与操作流程
1. 核心组分
组分 功能说明
RT-PCR预混液 含逆转录酶、热启动Taq酶、dNTPs（抗肝胰腺多糖干扰优化）
探针引物混合液 p74-FAM探针 + β-actin-HEX内标引物
阳性对照 灭活MBV泰国株RNA（NACA认证标准品）
快速裂解液 含离液盐和蛋白酶K，支持组织直接裂解（免提取，15分钟完成前处理）
2. 操作步骤（以肝胰腺样本为例）
样本处理：
50mg组织匀浆 + 200μL裂解液，95℃加热5分钟灭活病毒。
PCR扩增（25μL体系）：
50℃ 15min（RT）→ 95℃ 3min → [95℃ 10s → 60℃ 30s]×40 cycles
结果判读：
p74（FAM）Ct≤35 → MBV阳性；内标（HEX）Ct≤30 → 样本质量合格。
三、性能与质控
1. 关键参数
指标 性能标准 验证方法
灵敏度 100%检出（≥102拷贝/mg组织） 梯度稀释实验
特异性 不与WSSV、IHHNV交叉 30种常见水产病原验证
重复性 Ct值标准差≤0.5（n=10） 室内质控数据
2. 质控要求
每批次检测需包含：
阳性对照（Ct值28±2）
阴性对照（对虾健康组织）
无模板对照（NTC）
四、注意事项
采样规范
濒死对虾肝胰腺检出率最高，采样后立即置于RNA保存液中（-80℃保存≤3个月）。
生物安全
MBV属OIE须申报病原，实验废弃物需121℃高压灭菌30分钟。
局限性
不能区分疫苗株（如减毒活疫苗）与野生毒株。
五、应用场景
养殖场防控：
苗种检疫（杜绝带毒PL入池）。
发病期监测（病毒载量＞10拷贝/mg时死亡率＞80%）。
进出口贸易：
符合OIE《水生动物卫生法典》第2.2.8章检测要求。
科研应用：
病毒变异追踪（p74基因突变与毒力关联研究）。
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