匙形古柏线虫染料法荧光定量PCR试剂盒
商品属性
产品名称 | 匙形古柏线虫染料法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Cooperia oncophora Dye-based qPCR Kit |
规格 | 50T | 货号 | PR4247 |
产品用途
本试剂盒基于SYBR Green I荧光染料法，利用实时荧光定量PCR (qPCR) 技术，特异性检测牛羊粪便、环境样本或虫体样本中的匙形古柏线虫 (Cooperia oncophora) DNA。适用于：
牧场或养殖场寄生虫感染调查与监测
驱虫药药效评价
流行病学研究
临床兽医诊断辅助（需结合临床症状和其他检查）
检测原理
DNA提取： 需使用商业化的粪便基因组DNA提取试剂盒或相应方法从样本中提取总DNA（注：本试剂盒通常不包含DNA提取组分）。
特异性扩增： 试剂盒内包含针对匙形古柏线虫特异性基因靶标（通常是ITS-1, ITS-2, 18S rRNA或cox1基因的保守区域）设计的引物对。这些引物在PCR反应中特异性结合目标DNA序列。
荧光信号检测： PCR反应体系中包含SYBR Green I 荧光染料。该染料非特异性地嵌入双链DNA (dsDNA) 的小沟中。随着PCR扩增的进行，dsDNA产物（包括特异性目标产物和非特异性产物/引物二聚体）不断累积，SYBR Green I 嵌入后发出的荧光信号强度也随之增强。
实时定量与熔解曲线分析： 实时荧光定量PCR仪在每一个循环的延伸步骤后检测荧光信号强度。通过标准曲线或阈值循环数 (Ct值) 对目标DNA进行相对定量。反应结束后进行熔解曲线分析 (Melting Curve Analysis)：通过缓慢升高温度使dsDNA解链，监测荧光信号随温度的变化。特异性PCR产物具有特定的熔解温度 (Tm)，而引物二聚体等非特异性产物通常具有不同的（较低的）Tm值，据此可区分特异性扩增与非特异性扩增。
试剂盒组分 (以96次反应为例)
| 组分名称 | 体积/数量 | 储存条件 |
| 2X SYBR Green qPCR Master Mix | 1.25 mL x 2 管 | -20℃ |
| 包含： 高效热启动DNA聚合酶、dNTPs、优化缓冲液、SYBR Green I染料、稳定剂等 | | |
| 匙形古柏线虫特异性引物混合液 (Coop Primer Mix) | 150 μL x 1 管 | -20℃ |
| 包含： 针对匙形古柏线虫靶基因的特异性正向和反向引物 (工作浓度) | | |
| Nuclease-Free Water | 1.5 mL x 1 管 | 室温/-20℃ |
| 阳性对照 (Positive Control, PC) | 100 μL x 1 管 | -20℃ |
| 包含： 含有匙形古柏线虫靶基因片段的重组质粒或人工合成DNA片段 | | |
| 阴性对照 (Negative Control, NC) | 100 μL x 1 管 | -20℃ |
| 通常为： Nuclease-Free Water 或确定无靶DNA的样本提取液 | | |
用户需自备试剂与设备
样本DNA提取试剂盒 (用于粪便/组织/环境样本的DNA提取)
无核酸酶 (Nuclease-Free) 的PCR反应管或96孔板
光学平盖或封板膜
移液器及配套无菌、无核酸酶枪头
微型离心机
实时荧光定量PCR仪 (兼容SYBR Green检测通道，如Applied Biosystems, Bio-Rad, Roche LightCycler等主流型号)
冰盒
样本判读
样本出现典型S型扩增曲线且Ct值 ≤ 设定的阈值 (如35或38)，同时其熔解曲线峰值Tm值与阳性对照一致，可判为匙形古柏线虫DNA阳性。
若Ct值在阈值附近或熔解曲线不典型（如出现双峰、Tm值偏移），需谨慎判读，可能需重复实验或进一步验证（如测序）。
Ct值 > 阈值或无明显扩增曲线，判为阴性。
定量 (可选)： 如需相对定量，需在每次实验中同时运行含有已知拷贝数阳性模板（如梯度稀释的PC）的标准曲线。根据标准曲线计算样本中的目标基因相对量。
预期结果与熔解曲线
阳性对照 (PC)： Ct值通常较低且稳定 (具体范围取决于起始拷贝数)。熔解曲线在特定Tm值 (例如：85.0℃ ± 0.5℃，此为示例，实际值由引物决定) 处出现单一的尖锐主峰。
阴性对照 (NC)： 无扩增曲线 (Ct值无或>38/40)，熔解曲线无峰或出现宽泛低矮的非特异峰(Tm通常较低)。
阳性样本： 扩增曲线及Tm峰形与PC一致。
阴性样本： 扩增曲线及Tm峰形与NC一致。
注意事项
严格分区操作：试剂配制区、样品处理区、PCR扩增区需物理分隔，防止污染。
良好的实验室操作规范(GLP)：勤换手套，使用无核酸酶耗材，避免气溶胶污染。
试剂解冻后充分混匀，短暂离心。避免反复冻融，建议分装。
模板DNA避免含有高浓度抑制剂。如有必要，可对提取的DNA进行稀释或纯化。
熔解曲线分析是区分特异性产物与非特异性产物（如引物二聚体）的关键，务必进行并正确解读。
本试剂盒为染料法 (SYBR Green I)，对引物特异性和反应条件要求较高。引物二聚体或非特异扩增会产生假阳性信号。务必优化反应条件并仔细分析熔解曲线。
Ct值与样本中虫体数量/感染强度呈负相关，但直接转换为虫体数量需要建立标准曲线并与虫荷计数建立相关性模型。
结果判读需结合临床症状、流行病学史及其他实验室检查结果。
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关键字： 匙形古柏线虫;染料法荧光定量;RT-PCR试剂盒;