产品概述
鼠疫耶尔森菌（鼠疫杆菌）是甲类烈性传染病鼠疫的病原菌，传染性强、病死率高。本试剂盒基于SYBR Green I染料法荧光定量PCR技术开发，针对鼠疫杆菌高度保守基因序列设计特异性引物，可实现对鼠疫杆菌的快速定性检测和精准定量分析，适用于疾病防控、流行病学调查及科研实验等场景。本产品仅用于科研，严禁用于临床医疗及其他非科研用途。
产品名称 | 鼠疫耶尔森菌(鼠疫杆菌)染料法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Yersinia pestis Dye-based qPCR Kit |
产品规格 | 50T | 产品分类 | 荧光定量PCR |
检测类型 | PCR检测 | 产品货号 | PR4174 |
产品核心特点
操作便捷：即开即用，用户只需提供样品DNA模板即可开展实验
高特异性：引物针对鼠疫杆菌保守基因区域设计，与其他细菌无交叉反应
高灵敏度：最低检测限低至几百拷贝/反应，可精准识别低浓度样本
双模式检测：既可用于定性阴阳性判断，也能完成菌载量的精准定量
防污染设计：一管式闭管操作，降低交叉污染风险；仅提供无传染性DNA片段作为阳性对照
通量充足：本试剂盒足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应
标准规格与成分
成分 规格 用途说明
2×qPCR MagicMix 2.5mL 包含Taq酶、dNTPs、Mg²+、SYBR Green I染料等PCR核心反应体系
荧光PCR专用模板稀释液 1mL（黄盖） 用于稀释阳性对照和样品模板
鼠疫耶尔森菌PCR引物混合物 100μL（白盖） 针对鼠疫杆菌保守基因设计的特异性扩增引物
鼠疫耶尔森菌PCR阳性对照(1×10⁸拷贝/μL) 50μL（红盖） 无传染性DNA片段，验证PCR反应体系有效性
DNA病毒裂解液(试用装) 9mL 快速裂解细菌释放核酸，提供15次用量
使用手册 1份 详细操作指南与问题解决方案
操作流程
一、样品采集与预处理
食品样品：按《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验》要求进行采集与预培养
血液样品：用无菌注射器抽取2mL静脉血，注入EDTA-2Na/柠檬酸钠抗凝管并立即混匀
粪便样品：取新鲜粪便置于灭菌收集管送检
病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检
二、样品DNA制备
液体培养物：取100μL培养物，8000rpm离心3min弃上清，加入50μL DNA抽提液混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL作为PCR模板
固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL作为PCR模板
粪便样品：挑取米粒大小粪便于离心管，加入0.5mL生理盐水混匀，13000rpm离心3min弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL作为PCR模板
其他液体标本：取2-3mL标本，13000rpm离心3min弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL作为PCR模板
三、阳性对照梯度稀释（用于绘制标准曲线）
注意事项：阳性对照浓度极高，需在独立区域操作，避免污染其他试剂和样品
标记离心管：标记6个离心管，编号为7、6、5、4、3、2
加入稀释液：每管加入45μL荧光PCR专用模板稀释液
梯度稀释：
向7号管加入5μL原始阳性对照，震荡1分钟，得到1×10⁷拷贝/μL的稀释液
换枪头，取5μL 7号管稀释液加入6号管，震荡1分钟，得到1×10⁶拷贝/μL的稀释液
按上述方法依次稀释至2号管，最终得到10²-10⁷拷贝/μL的6个梯度浓度，置于冰上备用
四、qPCR反应体系配置（20μL体系）
组分 样品管 阴性对照 阳性对照
2×qPCR MagicMix 10μL 10μL 10μL
鼠疫耶尔森菌PCR引物混合液 2μL 2μL 2μL
自备10×ROX 2μL 2μL 2μL
样品DNA模板 6μL - -
灭菌双蒸水 - 6μL -
阳性对照稀释液 - - 6μL
注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器不需要使用ROX，则用水替代
五、PCR扩增程序设置
预变性：94℃ 5分钟
PCR循环（40次）：
变性：94℃ 30秒
退火延伸：58℃ 30秒（同时采集荧光信号）
数据处理与结果判读
定性检测
阴性对照：Ct值≥40或无扩增曲线，熔解曲线无特异性峰
阳性对照：Ct值≤30，有典型S型扩增曲线，熔解曲线出现特异性单峰
样品检测：
Ct值≤35：阳性（存在鼠疫耶尔森菌）
35<Ct<40：需重复实验，重复后Ct<40判为阳性，Ct≥40判为阴性
Ct值≥40：阴性（未检测到鼠疫耶尔森菌）
定量检测
以阳性对照浓度的log₁₀值为横轴，Ct值为纵轴绘制标准曲线
根据样品Ct值从标准曲线计算对应菌载量，计算公式：
菌载量（拷贝/μL）= 10^[(A-B)/C]
（A为截距，B为样品Ct值，C为斜率）
定量线性范围：10²-10⁷拷贝/μL
运输与保存要求
运输条件：采用泡沫箱加冰密封运输，低温冷链配送
保存条件：-20℃避光保存，有效期12个月；阳性对照需单独存放，避免污染其他试剂
注意事项：试剂避免反复冻融，使用前需充分混匀并短暂离心
注意事项
生物安全防护：实验操作需在生物安全三级防护条件下进行，穿戴实验服、手套、口罩、护目镜等防护用品
交叉污染防控：实验区域分为试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区，各区器材独立使用；使用带滤芯吸头，实验结束后用75%酒精或紫外灯消毒工作台
操作规范：严格按照说明书操作，试剂使用前自然融化并充分混匀；反应液需避光保存，避免荧光信号丢失
对照设置：每次实验必须设置阴阳性对照，以验证实验体系有效性
废弃物处理：所有实验废弃物需经高压灭菌处理后，按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理
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