乳双歧杆菌HN019探针法荧光定量PCR试剂盒
商品属性
产品名称 | 乳双歧杆菌HN019探针法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Bifidobacterium lactis HN019 Probe-based Fluorescent Quantitative PCR Kit |
规格 | 50T | 货号 | PR4655 |
预期用途
本试剂盒采用TaqMan探针法荧光定量PCR（qPCR）技术，用于特异性检测样品中乳双歧杆菌（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HN019菌株的DNA。适用于食品、保健品、药品、发酵制品、粪便样本、环境样本等中HN019菌株的定性和定量分析（需配合标准品）。
检测原理
本试剂盒基于实时荧光定量PCR技术，利用特异性引物扩增乳双歧杆菌HN019菌株的靶基因片段（通常为菌株特异性基因或SNP位点区域）。反应体系中包含一条与扩增片段内部序列特异性结合的荧光标记探针（通常为TaqMan探针）。探针5'端标记报告荧光基团（如FAM），3'端标记淬灭荧光基团（如BHQ1）。当探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在PCR扩增过程中，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性会将探针水解，使报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而释放荧光信号。荧光信号的强度与每个循环中扩增产物的数量成正比，通过监测荧光信号的增长，即可实现对起始模板DNA的定量检测。
主要组分
qPCR预混液 (2X)： 包含优化的缓冲液、dNTPs、热启动Taq DNA聚合酶、Mg²⁺等。可能包含ROX等被动参比染料（取决于仪器需求）。
乳双歧杆菌HN019特异性引物探针混合液： 包含针对HN019菌株设计的特异性正向引物、反向引物和荧光标记探针（如FAM/BHQ1标记）。浓度已优化。
无核酸酶水： 用于稀释和配制反应体系。
阳性对照 (Positive Control)： 含有已知浓度的乳双歧杆菌HN019基因组DNA片段或质粒DNA。
阴性对照 (Negative Control)： 无核酸酶水或不含目标DNA的缓冲液。
需要自备的材料与设备
实时荧光定量PCR仪（支持FAM通道，如ABI 7500, QuantStudio系列， Bio-Rad CFX系列， Roche LightCycler系列等）。
微量移液器（0.5-10μL, 10-100μL, 20-200μL）及配套无菌、无核酸酶吸头。
无菌、无核酸酶的PCR反应管或96孔/384孔PCR板。
涡旋混合器。
微型离心机。
冰盒。
生物安全柜或超净工作台（推荐用于样品处理）。
DNA提取试剂盒： 用于从样品中提取基因组DNA（需自备，推荐使用针对细菌或粪便样本的DNA提取试剂盒）。
用于制备标准曲线的标准品（可选，如需绝对定量，需自备或使用试剂盒可能提供的标准品）。
样品DNA制备
使用合适的商业DNA提取试剂盒，按照其说明书操作，从待测样品（如益生菌产品、粪便、发酵液等）中提取基因组DNA。
提取的DNA应尽快进行qPCR检测，或分装后于-20°C或-80°C保存。
建议使用分光光度计（如NanoDrop）或荧光染料法（如Qubit）测定DNA浓度和纯度（OD260/OD280应在1.8-2.0之间）。注意： 对于复杂样本（如粪便），杂质可能影响定量准确性，PCR抑制物检测是必要的（可选做）。
操作步骤
试剂准备与解冻： 取出试剂盒各组分，在室温下完全解冻（除酶外），短暂离心后置于冰上备用。qPCR预混液解冻后需充分混匀。
反应体系配制（以20μL体系为例，在冰上操作）：
qPCR预混液 (2X)： 10 μL
乳双歧杆菌HN019引物探针混合液： 2 μL
模板DNA： 2-5 μL (建议加入量对应DNA浓度在1-100 ng/μL范围内，或根据预实验优化)
无核酸酶水： 补足至 20 μL
示例总量： 20 μL
注意： 模板加入体积和浓度需优化，避免抑制剂干扰或浓度过高导致抑制。每个样本建议设置复孔。
对照设置：
阳性对照孔： 用阳性对照DNA代替模板DNA。
阴性对照孔 (NTC)： 用等体积无核酸酶水代替模板DNA。
样品阴性对照 (可选)： 使用确认为不含HN019的同类样品DNA。
混匀与离心： 轻轻涡旋或移液器吹打混匀各反应管/孔，避免产生气泡。短暂离心收集管壁液滴。
上机运行： 将反应管/板放入qPCR仪中，按照以下推荐的循环程序设置运行：
预变性： 95°C, 3-5分钟 (激活热启动酶)
循环扩增 (40-45个循环)：
变性： 95°C, 10-15秒
退火/延伸： 60°C, 30-60秒 (此步采集FAM通道荧光信号 - 关键步骤)
注：退火温度和时间需根据实际引物探针设计优化，通常说明书会明确给出。
数据分析： 运行结束后，仪器软件会自动生成扩增曲线和Ct (Threshold Cycle) 值。
设定阈值 (Threshold)： 通常在指数扩增期的上方，手动或自动设置，确保所有分析使用同一阈值。
设定基线 (Baseline)： 通常是前3-15个循环的背景荧光。
注意事项
污染控制： qPCR极其灵敏，必须严格分区操作（样品准备区、试剂配制区、扩增及产物分析区），使用带滤芯吸头，勤换手套，定期清洁台面和仪器，避免气溶胶污染。严禁将PCR产物带入前区。
试剂保存： -20℃避光保存。避免反复冻融，建议分装使用。使用前请充分混匀。解冻后在冰上操作。
模板要求： DNA样品应无降解，避免含有PCR抑制剂（如酚、氯仿、EDTA、肝素、腐殖酸、某些金属离子、高浓度盐等）。建议使用已知抑制物检测试剂盒验证或进行适当稀释。
反应体系优化： 首次使用或更换不同来源样品时，建议对模板加入量进行优化（如测试不同稀释倍数）。
仪器校准： 定期对qPCR仪进行光学校准和背景校准。
结果解释： qPCR检测的是特定DNA片段的存在，不能直接等同于活性菌的数量。样品中可能存在死菌或游离DNA。定量结果需结合DNA提取效率、样品类型等因素综合判断。
生物安全： 阳性对照可能含有DNA片段，需按生物废弃物处理。
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