赤霉菌探针法荧光定量PCR试剂盒
商品属性
产品名称 | 赤霉菌探针法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Gibberella Probe-based Fluorescent Quantitative PCR Kit |
规格 | 50T | 货号 | PR4816 |
检验原理
本试剂盒基于探针法荧光定量PCR技术，针对赤霉菌（Gibberella fujikuroi）高度保守基因区域设计特异性引物及探针，通过实时监测荧光信号实现核酸的定性与定量检测。
灵敏度：最低检测限达100拷贝/反应。
特异性：不与相近微生物DNA发生交叉反应。
线性范围：定量检测时覆盖5个数量级（10^1–10^6拷贝/μL）。
对照设置：提供无传染性DNA片段作为阳性对照，便于区分假阴性。
适用仪器
兼容主流荧光定量PCR仪，包括：
ABI系列（如7500、StepOnePlus）
安捷伦（MX3000P/3005P）
Roche LightCycler
Bio-Rad（CFX系列）
Eppendorf Mastercycler ep realplex
自备试剂与耗材
样本DNA：需用户自行提取（推荐柱式提取试剂盒或免提取核酸释放剂）。
耗材：无菌带滤芯枪头、PCR管、离心管、冰盒等。
操作步骤
1. 标准曲线制备（独立区域操作）
标记6管（6–1号），依次加入45 μL专用稀释液。
从阳性对照（10^7拷贝/μL）开始，10倍梯度稀释至10^1拷贝/μL（每步换枪头，冰上保存）。
2. 样本处理
设置N+2个提取（含阳性对照PC和阴性对照NC）。
PC：阳性对照稀释液（10^4拷贝/μL）模拟样本体积；NC：超纯水。
3. qPCR反应体系（20μL/管）
| 成分 | 样品管 | 阴性对照 | 标准曲线管 |
| qPCR缓冲液 | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| 酶混合液 | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
| 探针引物混合液 | 3 μL | 3 μL | 3 μL |
| 模板DNA | 5 μL | — | — |
| 标准曲线稀释液 | — | — | 5 μL |
| 超纯水（补足体积） | — | 5 μL | — |
4. 反应程序
预变性：95℃ 10 min
循环（40次）：95℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集FAM通道信号）
结果判读
定量分析：以阳性对照log浓度为横轴、Ct值为纵轴绘制标准曲线，计算样本浓度。
定性分析：
阳性：Ct≤36，且溶解曲线Tm值与对照一致。
阴性：Ct≥40。
可疑值（36<Ct<40）：需重复检测。
注意事项
分区操作：试剂配制、样本处理、扩增需在不同区域进行，避免交叉污染。
质量控制：
阴性对照无Ct值，阳性对照Ct≤36。
若阴性对照出现扩增，提示污染，实验无效。
局限性：
基因突变可能导致假阴性；
提取效率差异或运输不当可能影响结果准确性。
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