ATP含量测试盒 新品

ATP含量测试盒

测定意义与原理

测定意义

ATP（三磷酸腺苷）是生物体内能量的直接来源，其含量测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测心血管疾病、神经系统疾病、肌肉疾病等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解细胞代谢、细胞凋亡和细胞增殖机制环境监测：评估水体和土壤微生物污染程度食品检测：检测食品中微生物含量和新鲜度工业应用：优化生物发酵过程和生物技术生产工艺

测定原理

荧光素酶法（生物发光法）

ATP在荧光素酶催化下，与荧光素和O₂反应生成氧化荧光素、AMP、PPi和光，通过测定发光强度（RLU）计算ATP含量。反应式如下： ATP+荧光素+O2→荧光素酶氧化荧光素+AMP+PPi+光ATP+荧光素+O2荧光素酶氧化荧光素+AMP+PPi+光

分光光度法

ATP在己糖激酶（HK）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）催化下，与葡萄糖和NADP+反应生成NADPH，通过检测340nm处吸光度变化计算ATP含量。反应式如下： ATP+葡萄糖→HK葡萄糖-6-磷酸+ADPATP+葡萄糖HK葡萄糖-6-磷酸+ADP 葡萄糖-6-磷酸+NADP+→G6PDH6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+葡萄糖-6-磷酸+NADP+G6PDH6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+

HPLC法

ATP在高效液相色谱柱上分离，通过紫外检测器检测，根据保留时间和峰面积定量。

试剂盒组成

荧光素酶法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体100mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH7.8），用于提取样本中的ATP

试剂一 液体6mL×1瓶 含荧光素酶溶液，催化剂，用于催化ATP发光反应

试剂二 液体6mL×1瓶 含荧光素溶液，反应底物，用于ATP发光反应

试剂三 液体10mL×1瓶 含标准品（ATP），用于建立标准曲线

分光光度法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体100mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH7.4），用于提取样本中的ATP

试剂一 液体6mL×1瓶 含葡萄糖溶液，HK反应底物

试剂二 液体6mL×1瓶 含NADP+溶液，G6PDH反应辅酶

试剂三 液体6mL×1瓶 含己糖激酶（HK）溶液，ATP反应催化剂

试剂四 液体6mL×1瓶 含葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）溶液，NADP+反应催化剂

试剂五 液体10mL×1瓶 含标准品（ATP），用于建立标准曲线

自备仪器与试剂

必备仪器

荧光素酶法：荧光分光光度计/ATP检测仪/发光酶标仪（562nm检测通道）、超净工作台、恒温水浴锅、可调式移液器、低温离心机

分光光度法：紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）、台式离心机、水浴锅、可调式移液器

HPLC法：高效液相色谱仪、紫外检测器、C18色谱柱

通用：电子天平、研钵、一次性离心管、一次性吸头、冰和蒸馏水

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸

样本前处理方法

动植物组织样本取样：称取约0.1-0.2g组织，用生理盐水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：加入1-2mL提取液，冰浴匀浆离心：10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测稀释：若ATP浓度过高，用提取液稀释10-100倍后测定

细胞样本收集：收集1×10⁶细胞，加入1mL提取液破碎：冰浴超声波破碎（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

微生物样本收集：取1mL培养液或1g土壤/水样，加入9mL提取液振荡：振荡提取30min离心：10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/尿液样本血清：直接测定；若浓度过高，用提取液稀释10-100倍尿液：离心去除沉淀，取上清液测定；或用提取液稀释10-100倍

测定操作步骤

荧光素酶法操作试剂准备：

将荧光素酶和荧光素溶液按1:1比例混合，制备工作液，现配现用

将ATP标准品用提取液稀释成0、10、100、1000、10000、100000pmol/L系列浓度标准曲线绘制：

取100μL标准溶液于黑色96孔板中，加入100μL工作液

立即用荧光分光光度计测定发光强度（RLU），绘制标准曲线样品测定：

取100μL样品溶液，按标准曲线步骤操作，测定发光强度

根据标准曲线计算样品中ATP含量

分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零标准曲线绘制：

将ATP标准品用提取液稀释成0、10、20、30、40、50μmol/L系列浓度

取100μL标准溶液于比色管中，依次加入100μL试剂一、100μL试剂二、100μL试剂三、100μL试剂四，混匀

37℃水浴反应15min，测定340nm处吸光度，绘制标准曲线样品测定：

取100μL样品溶液，按标准曲线步骤操作，测定吸光度

根据标准曲线计算样品中ATP含量

结果计算方法

单位定义

pmol/mg 蛋白：每毫克组织蛋白中ATP的含量

nmol/g 鲜重：每克鲜重样本中ATP的含量

μmol/L：每升样本中ATP的含量

RLU：相对发光强度（荧光素酶法）

荧光素酶法计算公式

ATP含量(pmol/mg蛋白)=样品RLU值−空白RLU值标准品RLU值−空白RLU值×标准品浓度×稀释倍数÷蛋白浓度ATP含量(pmol/mg蛋白)=标准品RLU值−空白RLU值样品RLU值−空白RLU值×标准品浓度×稀释倍数÷蛋白浓度

分光光度法计算公式

ATP含量(nmol/g鲜重)=(A测定−A空白)×C标×V总(A标准−A空白)×WATP含量(nmol/g鲜重)=(A标准−A空白)×W(A测定−A空白)×C标×V总

A测定：样本管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

C标：标准品浓度（μmol/mL）

V总：样本提取液总体积（mL）

W：样本质量（g）

HPLC法计算公式

ATP含量(μmol/g)=样品峰面积×标准品浓度×样品稀释倍数标准品峰面积×样品质量(g)ATP含量(μmol/g)=标准品峰面积×样品质量(g)样品峰面积×标准品浓度×样品稀释倍数

性能指标

指标 荧光素酶法 分光光度法 HPLC法

线性范围 0~100000pmol/L 0~50μmol/L 0~1000μmol/L

最低检测限 ≤0.1pmol/L ≤0.1μmol/L ≤0.01μmol/L

回收率 90%~110% 90%~110% 95%~105%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤5.0% CV≤2.0%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤8.0% CV≤3.0%

稳定性 2-8℃保存12个月 2-8℃保存12个月 2-8℃保存12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免ATP水解；-70℃可保存3个月

操作过程需在4℃冰浴中进行，避免ATP酶活性升高

样本处理需迅速，避免ATP降解

试剂使用：

荧光素酶和荧光素溶液需-20℃避光保存，避免失活

工作液需现配现用，避免发光效率下降

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

荧光素酶法测定需在暗室中进行，避免外界光干扰

分光光度法反应温度需严格控制在37℃，反应时间15分钟

若发光强度或吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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