线粒体呼吸链复合体Ⅱ/琥珀酸辅酶Q还原酶测试盒
测定意义与原理
测定意义
线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶，是线粒体电子传递链与三羧酸循环链接的载体，其测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断Leigh综合征、嗜铬细胞瘤、肾上腺嗜铬细胞瘤等疾病疾病监测：评估线粒体功能障碍、能量代谢异常和神经病变等生物学研究：了解衰老、能量代谢、蛋白组学和病理生理学机制药物研发：筛选线粒体功能调节剂，用于治疗神经退行性疾病和代谢性疾病环境监测：评估环境毒物对线粒体功能的影响
测定原理
复合体Ⅱ催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基FAD还原为FADH₂，后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q；还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。反应式如下： 琥珀酸→复合体Ⅱ延胡索酸+FADH2琥珀酸复合体Ⅱ延胡索酸+FADH2 FADH2+氧化型辅酶Q→FAD+还原型辅酶QFADH2+氧化型辅酶Q→FAD+还原型辅酶Q 还原型辅酶Q+2,6-二氯吲哚酚→氧化型辅酶Q+还原型2,6-二氯吲哚酚还原型辅酶Q+2,6-二氯吲哚酚→氧化型辅酶Q+还原型2,6-二氯吲哚酚
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
缓冲液 20毫升×1瓶 含Tris-HCl缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境
反应液 2.5毫升×1瓶 含2,6-二氯吲哚酚溶液，反应底物
阴性液 2毫升×1瓶 用于背景对照，测定非特异性反应
底物液 500微升×1瓶 含琥珀酸溶液，复合体Ⅱ的反应底物
试剂五 粉剂×1瓶 含辅酶Q溶液，反应电子受体
试剂六 液体×1瓶 含酶制剂，用于加速反应
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度法/微量法：可见分光光度计/酶标仪（605nm检测通道）、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、电子天平
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、丙二酸钠（可选）
样本前处理方法
纯化线粒体样品提取：按照线粒体提取试剂盒说明书提取纯化线粒体溶解：线粒体样品检测前，须溶解；建议冻存融解(-70℃至37℃)循环3次浓度调整：建议待测样本线粒体蛋白浓度为10微克/100微升
细胞或组织裂解悬液样品取样：称取约0.1-0.2g组织，用生理盐水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：按照组织质量(g):缓冲液体积(mL)为1:5~10的比例进行冰浴匀浆裂解：加入裂解液，冰浴裂解30min离心：12000g 4℃离心30min，取上清液待测浓度调整：如果使用细胞或组织裂解悬液，蛋白浓度为50微克/100微升
测定操作步骤
仪器预热
分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。
工作液配制
临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
样本测定在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、25μL试剂六和200μL工作液，立即混匀记录605nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2同时设置阴性对照孔，用阴性液替代样本，同样操作记录吸光值变化
结果计算
酶活性(U/mg蛋白)=(ΔA样本−ΔA阴性)×V反总ε×d×Cpr×V样×T×106酶活性(U/mg蛋白)=ε×d×Cpr×V样×T(ΔA样本−ΔA阴性)×V反总×106
ΔA样本：样本管吸光度变化值
ΔA阴性：阴性对照管吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（L）
ε：摩尔消光系数（L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样：样本体积（L）
T：反应时间（min）
性能指标
指标 比色法/微量法
线性范围 0~100U/mg蛋白
最低检测限 ≤0.1U/mg蛋白
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免复合体Ⅱ失活；-70℃可保存3个月
线粒体样品检测前，须溶解；建议冻存融解(-70℃至37℃)循环3次
如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整
试剂使用：
工作液临用前配制，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融
反应液含有毒性物质，避免直接用手接触
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定
比色测定初始读数(0分钟读数)0.4左右为理想状态
反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续5分钟
比色测定后，比色皿须清洗彻底
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
安全提示：
本产品仅供科研研究使用，不得用于人体临床直接检测
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作
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