商品属性
产品名称 | NADH氧化酶（NOX）测试盒 | 产品货号 | BH-96117 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 辅酶Ⅰ系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
NADH氧化酶（NOX，EC1.6.3.1）是一类跨膜蛋白复合物，主要功能包括：活性氧（ROS）生成：催化NADH氧化生成O₂⁻，是细胞内ROS的主要来源信号转导：参与细胞增殖、分化、凋亡等生理过程的信号调节免疫防御：吞噬细胞通过NOX生成ROS杀灭病原体病理关联：NOX活性异常与心血管疾病、神经退行性疾病、肿瘤、糖尿病等密切相关
测定原理
NOX催化NADH氧化生成NAD+，同时将电子传递给O₂生成O₂⁻，通过偶联显色反应检测O₂⁻含量变化，计算酶活性： NADH+O2→NOXNAD++H2O2NADH+O2NOXNAD++H2O2 生成的O₂⁻与显色剂反应生成有色产物，在530nm处有特征吸收，吸光度增加速率与NOX活性成正比。
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（具备530nm检测通道）
台式高速离心机（最大转速≥12000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于细胞/细菌样本处理）
必备耗材
1mL玻璃比色皿/96孔板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性吸头（无菌无酶）
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（用于样本稀释）
液氮（用于样本速冻保存）
样本前处理方法
组织样本（动植物）新鲜样本取材后立即液氮速冻，-80℃保存；避免反复冻融称取0.05-0.1g组织，按1:5-10（W/V）比例加入预冷的提取液冰浴匀浆（转速1000-1500rpm，时间5-10min）转移至离心管，12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释后测定（建议稀释倍数1-10倍）
细胞/细菌样本收集对数生长期细胞（密度1×10^6/mL）或细菌（OD600=0.6-0.8）8000g 4℃离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤2次按500万细胞/细菌加入1mL提取液的比例重悬冰浴超声破碎（功率30%，超声5s，间隔10s，重复20次）12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
血清/血浆/尿液样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清血浆样本：加入抗凝剂后3000g 4℃离心10min，取上清尿液样本：直接取上清，若浑浊需3000g离心5min后取上清以上样本可直接检测，无需提取处理
测定操作步骤
比色法操作流程
试剂准备：
从4℃取出试剂盒，室温平衡20min
试剂A：显色剂，直接使用
试剂B：NADH溶液，使用前用蒸馏水稀释5倍
试剂C：反应缓冲液，直接使用
空白管设置：
取比色皿，依次加入：试剂C 900μL + 试剂B 50μL + 蒸馏水 50μL
37℃预温育5min，记录530nm处初始吸光度A0
样本测定：
另取比色皿，依次加入：试剂C 900μL + 试剂B 50μL + 样本 50μL
37℃预温育5min，立即记录530nm处吸光度A1
继续反应10min，记录吸光度A2
微量法（酶标仪）操作流程96孔板每孔加入：试剂C 90μL + 试剂B 5μL + 样本 5μL37℃预温育5min，酶标仪设置动力学模式，530nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度增加速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/mL：每mL样本每分钟生成1μmol O₂⁻的酶量
U/mgprot：每mg组织蛋白每分钟生成1μmol O₂⁻的酶量
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟生成1μmol O₂⁻的酶量
U/10⁴cell：每1万个细胞每分钟生成1μmol O₂⁻的酶量
计算公式
NOX活性=(ΔA样本−ΔA空白)×V反总×V样总ε×d×V样测×T×CNOX活性=ε×d×V样测×T×C(ΔA样本−ΔA空白)×V反总×V样总
ΔA：吸光度变化值（A2 - A1）
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：显色产物摩尔消光系数（3.6×10⁴ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
V样测：测定时加入的样本体积（0.05mL）
T：反应时间（10min）
C：样本浓度（蛋白浓度mg/mL、组织鲜重g/mL、细胞数10⁴/mL）
简化公式
血清/血浆样本：NOX（U/mL）= 2.78 × ΔA
组织样本（蛋白浓度）：NOX（U/mgprot）= 2.78 × ΔA ÷ Cpr
组织样本（鲜重）：NOX（U/g鲜重）= 2.78 × ΔA ÷ W
细胞/细菌样本：NOX（U/10⁴cell）= 0.056 × ΔA
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免反复冻融；若无法立即检测，-80℃可保存2周
组织匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，避免酶失活
离心时需控制温度与转速，确保充分分离细胞器
试剂使用：
试剂B（NADH）对光敏感，配制后需避光保存，24小时内用完
显色剂需现配现用，避免氧化失效
不同批号试剂禁止混用，避免影响检测结果
测定过程：
若ΔA值大于0.6，建议将样本稀释后重新测定
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物样本）或25℃（植物样本）
测定前需用蒸馏水校正分光光度计零点
质量控制：
每次实验需设置空白对照、阴性对照与阳性对照
若结果偏差较大，需检查样本处理过程与试剂配制是否正确
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