线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm)测试盒

线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm)测试盒

测定意义与原理

测定意义

ICDHm（EC1.1.1.41）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，在三羧酸循环中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，同时将NAD+还原为NADH，是三羧酸循环的限速酶之一，其催化的反应是细胞NADH主要来源之一。其活性测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测线粒体疾病、神经系统疾病、心血管疾病等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解线粒体功能、细胞凋亡和细胞增殖机制药物研发：筛选线粒体靶向药物，用于治疗线粒体疾病和神经退行性疾病环境监测：评估环境污染对生物线粒体的影响

测定原理

ICDHm催化NAD+还原生成NADH，NADH在340nm处有特征吸收峰；通过测定340nm吸光值的增加速率，即可计算出样本中ICDHm的活性。反应式如下： 异柠檬酸+NAD+→ICDHmα-酮戊二酸+CO2+NADH+H+异柠檬酸+NAD+ICDHmα-酮戊二酸+CO2+NADH+H+

试剂盒组成

紫外分光光度法试剂盒

组分 规格 作用说明

酸性提取液 25mL×1瓶 用于提取样本中的ICDHm

碱性提取液 25mL×1瓶 用于提取样本中的ICDHm

试剂一 液体5mL×1瓶 含缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境

试剂二 液体1.5mL×1支 含NAD+溶液，反应辅助因子

试剂三 粉剂×1支 含酶激活剂，用于提高ICDHm活性

试剂四 粉剂×1支 含显色剂，用于检测NADH

试剂五 液体0.7mL×1支 含标准品（NADH），用于建立标准曲线

试剂六 液体10mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH7.4），用于配制工作液

试剂七 自备 19.2mL乙醇和0.8mL蒸馏水充分混合备用

微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

试剂一 液体20mL×1瓶 含提取液，用于提取样本中的ICDHm

试剂二 液体1.5mL×1支 含NAD+溶液，反应辅助因子

试剂三 液体25mL×1瓶 含缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境

试剂四 粉剂×1支 含酶激活剂，用于提高ICDHm活性

试剂五 粉剂×1支 含显色剂，用于检测NADH

试剂六 液体0.7mL×1支 含标准品（NADH），用于建立标准曲线

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度法：紫外分光光度计、1mL石英比色皿、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水

微量法：酶标仪、96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水

通用：超声破碎仪、恒温水浴锅、电子天平、显微镜、pH计

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、漏斗、滤纸

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、PBS缓冲液、蔗糖、Tris、HCl、EDTA、MgCl₂、蛋白酶抑制剂等

样本前处理方法

动植物组织样本取样：称取约0.1g组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干匀浆：加入1mL酸性提取液和10μL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆低速离心：600g 4℃离心5min，弃沉淀高速离心：11000g 4℃离心10min，弃上清，沉淀即为线粒体线粒体裂解：沉淀中加入200μL碱性提取液和2μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）检测：裂解液用于ICDHm酶活性测定

细胞样本收集：收集500万细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：加入1mL酸性提取液和10μL试剂三，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

血清/血浆样本可直接检测；若浓度过高，用提取液稀释10-20倍

测定操作步骤

紫外分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，用蒸馏水调零工作液配制：临用前将试剂三加入1.6mL双蒸水，混匀，4℃保存一周；将试剂四加入1.9mL双蒸水，混匀，4℃保存一周标准曲线绘制：

将NADH标准品稀释成0、10、20、30、40、50nmol/L系列浓度

取100μL标准溶液于比色管中，加入100μL试剂二、100μL试剂三，混匀，37℃水浴30min

加入100μL试剂四，混匀，室温反应15min，测定340nm吸光度，绘制标准曲线样品测定：

取100μL样本溶液于比色管中，加入100μL试剂二、100μL试剂三，混匀，37℃水浴30min

加入100μL试剂四，混匀，室温反应15min

测定340nm吸光度，根据标准曲线计算样本中ICDHm活性

微量法操作仪器预热：酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm工作液配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融标准曲线绘制：

将NADH标准品稀释成0、10、20、30、40、50nmol/L系列浓度

取96孔板，加入10μL标准溶液、200μL工作液和15μL试剂六，混匀，记录340nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1，绘制标准曲线样品测定：

取96孔板，加入10μL样本、200μL工作液和15μL试剂六，混匀，记录340nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1

根据标准曲线计算样本中ICDHm活性

结果计算方法

单位定义

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1μmol NADH的酶量

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟生成1μmol NADH的酶量

U/L：每升样本每分钟生成1μmol NADH的酶量

计算公式

ICDHm活性(U/mg prot)=(ΔA样本−ΔA空白)×V总Cpr×V样×ε×d×T×106ICDHm活性(U/mg prot)=Cpr×V样×ε×d×T(ΔA样本−ΔA空白)×V总×106

ΔA样本：样本管吸光度变化值

ΔA空白：空白管吸光度变化值

V总：反应体系总体积（L）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样：样本体积（L）

ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

T：反应时间（min）

性能指标

指标 紫外分光光度法/微量法

线性范围 0~50nmol/L

最低检测限 ≤0.1nmol/L

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤1.7%

批间精密度 CV≤5.0%

稳定性 2-8℃保存12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免ICDHm失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

试剂使用：

试剂三、试剂四需临用前配制，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

加入试剂后需充分混匀，确保反应完全

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

公司正在出售的产品