商品属性
产品名称 | 脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）测试盒 | 产品货号 | BH-961144 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 维生素C代谢系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR，EC1.8.5.1）是抗坏血酸（AsA）-谷胱甘肽（GSH）循环中的关键酶，主要功能包括：抗坏血酸再生：催化脱氢抗坏血酸（DHA）还原为AsA，维持细胞内AsA的水平抗氧化防御：清除活性氧，保护细胞膜免受氧化损伤信号转导：参与氧化还原信号传导，调节细胞生长、发育和应激响应品质调控：影响农产品的抗氧化能力和贮藏保鲜期
测定原理
DHAR催化GSH还原DHA为AsA，同时GSH被氧化为GSSG，通过测定340nm处GSH的氧化速率（吸光度下降速率），计算DHAR活性。反应式如下： DHA+2GSH→DHARAsA+GSSGDHA+2GSHDHARAsA+GSSG
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂一 50mL×1瓶/100mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.0，用于反应体系构建
试剂二 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含10mmol/L脱氢抗坏血酸（DHA），反应底物
试剂三 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含20mmol/L还原型谷胱甘肽（GSH），电子供体
试剂四 5mL×1瓶/10mL×1瓶 含0.1mol/L EDTA，金属离子螯合剂
标准品 1×100U 用于校准仪器，建立标准曲线
提取液 100mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.4，用于样本提取
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外/可见分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）
低温离心机（≥8000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
必备耗材
1mL石英比色皿/96孔板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
手术剪/镊子（用于组织样本处理）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（0.85% NaCl）
抗凝剂（肝素/EDTA，仅用于血浆样本）
样本前处理方法
动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取约0.1g组织，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定
细菌/细胞样本收集对数生长期细菌/细胞，8000g 4℃离心5min弃上清按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)=500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本：加入抗凝剂（肝素/EDTA）后3000g 4℃离心10min，取上清样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释
测定操作步骤
紫外分光光度法操作
试剂准备：
试剂一：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.0，4℃保存
试剂二：10mmol/L脱氢抗坏血酸（DHA）溶液，-20℃避光保存
试剂三：20mmol/L还原型谷胱甘肽（GSH）溶液，-20℃避光保存
试剂四：0.1mol/L EDTA溶液，4℃保存
工作液：试剂一 + 试剂二 + 试剂三 + 试剂四，按体积比100:5:5:2混合，现配现用
预温育：
分光光度计预热30min，调节波长到340nm，用蒸馏水调零
工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）水浴中预热10min以上
反应启动：
取比色皿，依次加入：工作液950μL + 样本50μL
混匀，记录340nm波长下0min（A1）和1min（A2）时的吸光度值
计算ΔA：ΔA = A1 - A2
酶活性计算：
根据ΔA值，按照公式计算DHAR活性
微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：工作液95μL + 样本5μL37℃预温育5min，加入样本后立即混匀设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度下降速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟催化1μmol底物反应的酶量
U/mL：每mL样本每分钟催化1μmol底物反应的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分钟催化1μmol底物反应的酶量
计算公式
DHAR活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×V样总ε×d×Cpr×V样测×TDHAR活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样测×TΔA×V反总×V样总
ΔA：1min内吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：GSH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样测：测定时加入样本体积（0.05mL）
T：反应时间（1min）
简化公式
组织样本：DHAR（U/g鲜重）= 0.322 × ΔA ÷ W
液体样本：DHAR（U/mL）= 0.322 × ΔA
蛋白样本：DHAR（U/mgprot）= 0.322 × ΔA ÷ Cpr
性能指标
指标 要求
线性范围 0~100U/mL，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤0.5U/mL
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 4℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月
匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃
样本需避免氧化，处理过程中尽量减少与空气接触
试剂使用：
脱氢抗坏血酸（DHA）溶液对光敏感，配制后需避光保存
还原型谷胱甘肽（GSH）溶液需现配现用，避免氧化
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）
若ΔA值大于0.3，需稀释样本后重新测定
每个样本需设置平行实验，结果取平均值
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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