商品属性
产品名称 | 二胺氧化酶(DAO)测试盒 | 产品货号 | BH-961161 |
规格 | 100管/48样、50管/24样 | 产品分类 | 氧化与抗氧化系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
二胺氧化酶（DAO，EC1.4.3.22）是一种含铜胺氧化酶，主要功能包括：组胺代谢：催化组胺、尸胺等多胺类物质氧化脱氨肠屏障功能标记：DAO主要存在于小肠黏膜绒毛上层，是小肠黏膜完整性的敏感指标疾病诊断：在肠道疾病、腹腔感染、创伤、休克等情况下，DAO释放到血液中，血清DAO升高炎症反应调节：抑制DAO活性可导致组胺积累，加重炎症反应
测定原理
采用比色法，DAO催化组胺氧化生成醛、氨和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶（POD）作用下与4-氨基安替比林和苯酚反应生成红色醌类化合物，根据生成量推算DAO活力。反应式如下： 组胺+O2+H2O→DAO醛+NH3+H2O2组胺+O2+H2ODAO醛+NH3+H2O2 H2O2+4-氨基安替比林+苯酚→POD红色醌类化合物+H2OH2O2+4-氨基安替比林+苯酚POD红色醌类化合物+H2O
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂一 25mL×1瓶/50mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.4，用于反应体系构建
试剂二 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含组胺溶液，反应底物
试剂三 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含过氧化物酶（POD）、4-氨基安替比林和苯酚，用于显色反应
试剂四 1mL×1支/2mL×1支 含100U DAO标准品，用于建立标准曲线
提取液 100mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.4，用于样本提取
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度计/酶标仪（510nm检测通道）
低温离心机（≥8000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
必备耗材
1mL玻璃比色皿/96孔板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
手术剪/镊子（用于组织样本处理）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（0.85% NaCl）
抗凝剂（肝素/EDTA，仅用于血浆样本）
样本前处理方法
动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取约0.1g组织，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若DAO活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定
细菌/细胞样本收集对数生长期细菌/细胞，8000g 4℃离心5min弃上清按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)=500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
液体样本（血清/血浆/尿液等）血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本：加入抗凝剂（肝素/EDTA）后3000g 4℃离心10min，取上清样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释
测定操作步骤
分光光度法操作
试剂准备：
试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存
试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存，用时加10mL蒸馏水溶解
试剂三：液体10mL×1瓶，-20℃保存，用时加10mL蒸馏水溶解
工作液：试剂一 + 试剂二 + 试剂三，按体积比10:1:1混合，现配现用
预温育：
分光光度计预热30min，调节波长到510nm，蒸馏水调零
工作液在37℃水浴中预热10min以上
反应启动：
取比色皿，依次加入工作液950μL + 样本50μL
立即混匀，记录510nm波长下0min（A1）和1min（A2）时的吸光度值
计算ΔA：ΔA = A2 - A1
微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：工作液95μL + 样本5μL37℃预温育5min，加入样本后立即混匀设置动力学模式，510nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度上升速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟催化1μmol底物反应的酶量
U/mL：每mL样本每分钟催化1μmol底物反应的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分钟催化1μmol底物反应的酶量
计算公式
DAO活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×V样总ε×d×Cpr×V样测×TDAO活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样测×TΔA×V反总×V样总
ΔA：1min内吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：摩尔消光系数
d：比色皿光径（1cm）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样测：测定时加入样本体积（0.05mL）
T：反应时间（1min）
简化公式
组织样本：DAO（U/g鲜重）= (A样 - A空) × 0.01 × V总 ÷ W
液体样本：DAO（U/mL）= (A样 - A空) × 0.01
性能指标
指标 要求
线性范围 0~100U/mL，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤0.5U/mL
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 4℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月
匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃
样本需避免氧化，处理过程中尽量减少与空气接触
试剂使用：
显色剂对光敏感，配制后需避光保存
标准品需现配现用，避免分解
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃
若ΔA值大于0.3，需稀释样本后重新测定
每个样本需设置平行实验，结果取平均值
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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