肝脂酶（HL）测试盒

肝脂酶（HL）测试盒

测定意义与原理

测定意义

肝脂酶（HL）是一种脂肪分解酶，在肝实质细胞中合成，存在于肝脏窦周间隙内皮细胞表面和窦周间隙腔面的肝细胞微绒毛表面，可水解各种脂蛋白中的甘油三酯（TG）和磷脂（PL），使各种脂蛋白颗粒的大小和密度发生变化。其活性检测具有重要意义：临床诊断：诊断和监测动脉粥样硬化、冠心病、高脂血症、肝脏疾病等疾病监测：评估脂肪代谢状态、血脂水平和治疗效果生物学研究：了解脂肪代谢、脂蛋白代谢和动脉粥样硬化发病机制药物研发：筛选降脂药物、抗动脉粥样硬化药物等

测定原理

可见分光光度法/微量法：肝脂酶水解α-乙酸萘酯产生α-萘酚，α-萘酚可与固蓝B盐形成紫红色偶氮化合物，在595nm有特征吸收峰，其颜色深浅在一定范围内与肝脂酶活性成正相关。反应式如下： α-乙酸萘酯→肝脂酶α-萘酚+乙酸α-乙酸萘酯肝脂酶α-萘酚+乙酸 α-萘酚+固蓝B盐→紫红色偶氮化合物α-萘酚+固蓝B盐→紫红色偶氮化合物

ELISA法：采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法，将标准品、待测样本加入到预先包被人肝脂酶多克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中人肝脂酶浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中人肝脂酶含量。

试剂盒组成

可见分光光度法/微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体60mL×1瓶 用于提取样本中的肝脂酶

试剂一 液体45mL×1瓶 含反应缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境

试剂二 粉剂×1瓶 含α-乙酸萘酯溶液，反应底物

试剂三 粉剂×1瓶 含固蓝B盐溶液，显色剂

标准品 1mL×1支 含α-萘酚标准液，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗肝脂酶单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗肝脂酶抗体

标准品 液体1mL×6管 含0.1-10ng/mL肝脂酶标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

可见分光光度法/微量法：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研钵、电子天平

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

动植物组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

细胞/微生物样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率300W，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）离心：10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

血清(浆)样品：直接检测

测定操作步骤

可见分光光度法/微量法操作仪器预热：可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到595nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用

试剂三：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

混匀后立即记录595nm处反应5min时的吸光值A1和10min时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1标准曲线绘制：将α-萘酚标准品稀释成0、10、20、30、40、50U/L系列浓度，同样处理，测定10min内吸光度变化，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mL：每毫升样本每分钟生成1μmolα-萘酚的酶量

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1μmolα-萘酚的酶量

ng/mL：每毫升样本中肝脂酶的含量

可见分光光度法/微量法计算公式

肝脂酶活力(U/mL)=(A测定−A空白)(A标准−A标准空白)×标准品浓度×V总V样×反应时间×稀释倍数肝脂酶活力(U/mL)=(A标准−A标准空白)(A测定−A空白)×标准品浓度×V样V总×反应时间×稀释倍数

A测定：测定管吸光度值

A空白：测定空白管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

A标准空白：标准空白管吸光度值

V总：反应总体积（mL）

V样：取样量（mL）

反应时间：10min

ELISA法计算公式

肝脂酶含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数肝脂酶含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 可见分光光度法/微量法 ELISA法

线性范围 0~18U/L 0.1-10ng/mL

最低检测限 ≤1.2U/L ≤0.05ng/mL

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤8.3% CV≤5.0%

批间精密度 CV≤10% CV≤8.0%

稳定性 4℃保存6-12个月 2-8℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免肝脂酶失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

试剂使用：

试剂需临用前配制，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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