商品属性
产品名称 | 谷氨酸合成酶（GOGAT）测试盒 | 产品货号 | BH-961190 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 氮代谢系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
谷氨酸合成酶（GOGAT）是生物体内氮代谢途径的关键酶，具有重要的生理功能和应用价值：植物生理学：参与氨同化过程，与谷氨酰胺合成酶共同构成GS/GOGAT循环微生物学：参与微生物的氮代谢，影响微生物的生长和繁殖医学研究：与神经系统疾病、肿瘤等疾病的发生发展密切相关生物工程：在氨基酸发酵、蛋白质合成等领域有重要应用农业科学：反映植物氮营养状况，指导合理施肥
测定原理
采用偶联酶法，GOGAT催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸，同时NADH氧化生成NAD+，340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。反应式如下： 谷氨酰胺+α-酮戊二酸+NADH+H+→GOGAT2谷氨酸+NAD+谷氨酰胺+α-酮戊二酸+NADH+H+GOGAT2谷氨酸+NAD+
根据还原剂不同，GOGAT分为两种类型：NADH-GOGAT（EC 1.4.1.14）：以NADH为还原剂，主要存在于非绿色组织中Fd-GOGAT（EC 1.4.7.1）：以铁氧还蛋白为还原剂，主要存在于叶绿体中
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂一 液体30mL×1瓶 含0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，提供酶促反应环境
试剂二 粉剂×1瓶 含谷氨酰胺底物，需临用前加入5mL蒸馏水溶解
试剂三 粉剂×1瓶 含α-酮戊二酸，需临用前加入50μL试剂七润湿，然后加入10mL试剂一溶解
试剂四 粉剂×1瓶 含NADH，需临用前加入20mL蒸馏水溶解
试剂五 液体3mL×1瓶 含提取液，用于动植物组织样本提取
标准品 液体1mL×1支 含0.05mg/mL标准酪氨酸溶液，用于校准和验证
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）
低温离心机（≥8000g）
恒温水浴锅/金属浴（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（10-1000μL）
组织匀浆器/研钵
超声波破碎仪
必备耗材
离心管（1.5mL、10mL）、一次性吸头、手术剪/镊子
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
植物组织样本取新鲜植物组织约0.1g，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分加入1mL提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定
微生物样本收集500万对数生长期细胞，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL提取液，冰浴超声波破碎（功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测样本可-20℃保存3个月，避免反复冻融
动物组织样本取动物组织约0.1g，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分加入1mL提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测样本可-20℃保存3个月，避免反复冻融
血清/血浆样本血清样本：室温血液自然凝固10-20分钟后，2000-3000r/min离心20分钟左右，收集上清血浆样本：用肝素/柠檬酸钠抗凝，5000g 4℃离心10min，取上清直接测定样本避免溶血，溶血会导致结果偏高
测定操作步骤
分光光度法操作仪器预热：紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零工作液配制：临用前将试剂二、三、四转移到试剂一中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用样本测定：
取0.1mL样本和1mL工作液于1mL比色皿中，混匀，加工作液的同时开始计时
记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA = A1 - A2
空白对照：取0.1mL提取液替代样本，同样处理标准曲线：将标准品用提取液稀释成0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL系列浓度，同样处理
ELISA法操作取96孔板，加入标准品/样本50μL + HRP标记检测抗体100μL，37℃温育60min弃去液体，洗涤5次，每次300μL加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min加入终止液50μL，15min内在450nm波长下测定吸光度
结果计算方法
单位定义
U/mgprot：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH的酶量
U/g鲜重：每g组织每分钟消耗1nmol NADH的酶量
U/10⁴cell：每10⁴个细胞每分钟消耗1nmol NADH的酶量
计算公式
GOGAT酶活(U/mgprot)=ΔA×V反总ε×d×t×Cpr×V样×109GOGAT酶活(U/mgprot)=ε×d×t×Cpr×V样ΔA×V反总×109
ΔA：340nm处吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（L）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
t：反应时间（min）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样：样本加入体积（L）
简化公式
按蛋白计算：GOGAT酶活（U/mgprot）= 107.18 × ΔA ÷ Cpr
按鲜重计算：GOGAT酶活（U/g鲜重）= 107.18 × ΔA ÷ W
性能指标
指标 要求
线性范围 0~0.05mg/mL标准酪氨酸当量，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤0.005mg/mL
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶活性失活；-20℃可保存3个月
提取过程需在冰浴中进行，防止GOGAT失活
样本处理需避免高温和光照，防止NADH降解
试剂使用：
NADH溶液需现配现用，或分装-20℃避光保存
底物溶液需临用前配制，避免分解
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应时间需严格控制，保持线性范围内的吸光度变化
测定需在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）条件下进行
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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