细胞壁不溶性酸性转化酶（BAI）测试盒
测定意义与原理
测定意义
蔗糖转化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适pH,Ivr分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。AI的最适pH为3~5,分为可溶性AI(S-AI)和细胞壁不溶性AI(B-AI)两种类型。B-AI存在于细胞间隙并结合在细胞壁上,主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解,以维持库源之间的蔗糖浓度。
测定原理
B-AI催化蔗糖降解产生还原糖,进一步与3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,在510nm有特征光吸收,在一定范围内510nm光吸收增加速率与B-AI活性成正比。
试剂盒组成
可见分光光度法/微量法试剂盒
组分 规格 作用说明
提取液1 液体100mL×1瓶 用于初步提取样本中的B-AI
提取液2 液体100mL×1瓶 用于提取细胞壁结合的B-AI
试剂一 液体10mL×1瓶 含缓冲液和底物蔗糖溶液
试剂二 粉剂×1瓶 含3,5-二硝基水杨酸，显色剂
试剂三 液体15mL×1瓶 含NaOH和酒石酸钾钠，显色辅助剂
自备仪器与试剂
必备仪器
可见分光光度法/微量法：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
植物组织样本取样：按照组织质量(g):提取液1体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液1),进行冰浴匀浆。离心：12000g 4℃离心10min,弃上清,沉淀中加入1mL蒸馏水,充分震荡混匀,12000g 4℃离心10min,弃上清,沉淀中加入1mL提取液2充分混匀,4℃浸提过夜,12000g 4℃离心20min,取上清置冰上待测。
血清/血浆样本处理：直接检测。
细菌、细胞样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次)离心：8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定操作步骤
可见分光光度法/微量法操作仪器预热：分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至510nm,蒸馏水调零。试剂配制：
试剂二工作液：临用前加入10mL试剂一充分溶解备用;用不完的试剂4℃保存。样本测定：(在EP管中依次加入下列试剂):
试剂名称(μL) 测定管 对照管
样本 50 50
试剂一 200
试剂二 200
混匀,37℃准确水浴30min后,95℃水浴10min(盖紧,以防水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)
加入125μL试剂三,混匀,95℃水浴10min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,510nm处记录各管吸光值A,如果吸光值大于2,可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数),ΔA=A测定-A对照。每个测定管设一个对照管。
结果计算方法
单位定义
μg/min/mgprot：37℃每mg蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
μg/min/g鲜重：37℃每g组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
计算公式
按蛋白浓度计算： B-AI活性(μg/min/mgprot)=20.8×(ΔA+0.001)CprB-AI活性(μg/min/mgprot)=20.8×Cpr(ΔA+0.001)
按鲜重计算： B-AI活性(μg/min/g鲜重)=20.8×(ΔA+0.001)WB-AI活性(μg/min/g鲜重)=20.8×W(ΔA+0.001)
ΔA：样本管吸光度变化值
Cpr：样本蛋白质浓度（mg/mL）
W：样本质量（g）
性能指标
指标 可见分光光度法/微量法
线性范围 0~1000μg/mL
最低检测限 ≤0.05μg/mL
回收率 99%~103.3%
批内精密度 CV≤1.7%
批间精密度 CV≤5.0%
稳定性 2~8℃保存6个月
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备,避免B-AI失活；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆,避免酶失活
超声波破碎时需控制功率和时间,避免样本降解
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
试剂使用：
显色剂工作液需临用前配制,避免氧化失效
不同批号试剂不能混用,需重新绘制标准曲线
标准品需4℃保存,避免反复冻融
测定过程：
沸水浴时间需严格控制在10min,避免颜色过深
显色后需立即测定,避免颜色褪去
若吸光度值超出线性范围,需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器,确保检测结果准确性
若结果偏差较大,需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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