B16-F10-GFP/mCherry-luc黑色素瘤稳转细胞株

B16-F10-GFP/mCherry-luc小鼠黑色素瘤细胞

• 细胞名称   B16-F10-GFP/mCherry-luc
• 组织  小鼠黑色素瘤细胞系
• 母细胞来源  ATCC
• 转染方法与标记过程的描述 慢病毒转染Hygromycin筛选 

质粒部分

1.酶切载体：pGL4.10（luc2）由酶切获得1400bp的luc2基因片断；EGFP和mCherry片段由PCR扩增获得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A载体酶切线性化。

2.电泳和胶回收：上述酶切产物DNA电泳，TAKARA试剂盒胶回收，回收产物取少量电泳鉴定。

3.连接载体与目的片段:使用Invitrogen T4连接酶连接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A线性化载体，连接使用20ul体系，25℃，10min。

4.转化：感受态菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入连接产物，静置25min后在水浴42℃，45sec热休克，后加入250ul无抗培养基225转摇菌1h，将转化的菌铺于有氨苄抗性平板37度过夜。

5.挑取单克隆：观察平板后挑取15个单克隆至含2ml氨苄抗性 LB培养基摇菌管中，255转摇菌6.5h。

6.小抽质粒与鉴定：使用碱裂解法小抽，质粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鉴定: 重组质粒用通过酶切鉴定。

7.荧光素表达鉴定: 重组质粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下简称Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下简称Mluc） 转染293T细胞：DNA定量后，使用PEI转染Gluc或Mluc至24孔板已预铺的293T细胞中。转染采用脂质体法转染，试剂采用JetPEI (Polyplus公司)。两管EP管中分别加入50ul生理盐水，其中一管加入1ug量的质粒（DNA体积=1ug/DNA浓度），轻轻震荡混匀，再轻微离心；在另一管中加入PEI 2ul轻轻震荡混匀，轻微离心，然后把PEI管中的溶液加入含有的质粒管中，室温孵育20min。将脂质体包绕DNA的混合液加入需要转染的24孔内，37 ℃、5 % CO2条件下培养，8小时后换培养液。

8.报告基因检测：Passive Lysis Agent裂解细胞，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。

9.质粒中抽：取1ml转染报告基因检测正确的菌液加入100ml氨苄抗性的LB培养基中摇菌过夜，使用Invitrogen试剂盒中抽，产物电泳鉴定，－20℃保存。

慢病毒包装部分

1. 质粒共转染细胞：转染前一天，293T在10cm培养盘中的细胞达到90％，胰酶消化后，1：3传入新10cm培养盘中。转染时，细胞在培养盘中密度达到80％。采用脂质体PEI转染法使编码慢病毒包膜蛋白的质粒VSV G，Packaging Mix以及构建的Gluc或Mluc质粒15µg共转染。6h后换新鲜DMEM培养基。

2．提取病毒上清：转染48-72hours后，将含有病毒液的培养基转移到15ml离心管中,在低温4摄氏度条件下，3000rpm，离心10min去除片状沉淀的细胞碎片。

3．浓缩病毒：将病毒上清用0.45um滤器过滤至浓缩离心管中，2000rpm，4℃，15min离心。浓缩液收集于500µl离心管中，-80℃保存。

慢病毒感染&筛选

1.感染前一天(Day1)，消化B16-F10细胞并计数，将细胞铺于24孔板中（以便在感染前细胞达到30%-50%的汇合度），37°C过夜孵化细胞。

2.(Day2) 解冻低温保存的慢病毒液，并且制备1：2病毒稀释液200µl加入细胞中。

3.向每孔加入Polybrene达到终浓度6ug/ml，晃匀孔板，37度孵化过夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培养基，加入500µl完全培养基。

5.(Day4)换液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。

6.(Day4－7），每24h换液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。

维持培养。

7.(Day8－12）细胞逐渐由24孔板传入6孔板、6cm盘和10cm盘中100µg/ml Hygromycin维持培养。

8. B16-F10-Gluc/Mluc细胞系鉴定: 取5×10⁴细胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。GFP和mCherry表达通过荧光显微镜观察。

• 培养条件 ：置于37℃、5％CO₂培养箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％双抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml链霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的1640培养基培养，培养三天（密度大概80%）按照1：3的比例传代。

【注意事项】不能用高糖的DMEM培养，否则细胞形态会出现很多颗粒，边缘不清晰，呈现锯齿状。

• 细胞传代所需时间：3天/代 
• 筛选标记维持压力和选择压力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。
• 体外实验数据：活体成像  尾静脉接种，2周后检测到肺转移，4周转移很多，小鼠接近死亡。

上海科远迪生物科技有限公司成立于2007年，致力于活体生物发光、荧光成像技术和医学冻存技术在中国的推广和应用！目前在南京、杭州等地有10多家代理商。人民卫生出版社2010年出版的《高等学校创新教材-医学实验技术系列》之《组织学与胚胎学实验技术》分册首次将活体动物体内功能成像技术（该书第十一章）写进医学院校教材，标志着该技术在国内的普及应用又上新台阶！本公司创始人参与了第十一章 《活体动物体内功能成像技术》的编写工作！本公司与交通大学第六人民医院合作完成的 《活体生物发光成像技术及其在消化道研究领域中的应用》一文发表在《胃肠病学和肝病学杂志》2010年第四期，本项目由上海市自然科学基金项目(No.04ZB14072) 资助。本公司与浙江大学基础医学院李继承教授，李冬梅博士合作完成的《小动物活体成像技术研究进展》一文发表在《中国生物医学工程学报》2009,28(6):916-921。? ? 我们经过长期的实验研究与反复验证，研发出一系列Livecyte?即用型细胞冻存液系列产品，能有效地提高常规细胞、原代细胞与干细胞的复苏后存活率与活力。产品质量稳定可靠、使用方便，助力科研工作者摆脱程序繁琐、操作复杂、容易污染的传统冻存方法，专注于后续实验研究。该系