MCF-7 / mRFP-EGFP-LC3稳转细胞株

MCF-7 / mRFP-EGFP-LC3稳转细胞株

质粒来源：Addgene # 21074 ( 载体pEGFP-C1+mRFP；插入基因 Rat LC3B，GenBank ID: U05784 )

背景：自噬为机体在亚细胞水平的“自我吞噬”，可以帮助细胞维持自身稳态及适应应激环境。近年来，自噬已成为生物学领域中的一个研究热点。迄今研究发现，自噬可以参与多种疾病的发生发展，例如肿瘤，心血管疾病，神经退行性疾病等。因而，自噬在各类相关疾病研究中作为药物筛选靶点越来越受关注和讨论。自噬研究的基础是有效地观察，定量细胞中自噬的发生。而目前应用较为广泛的自噬检测方法为观察GFP-LC3荧光斑，细胞正常生理环境LC3呈弥散状分布，自噬激活时LC3会转移至自噬囊泡上，因此，GFP荧光的弥散或斑点状聚集可以比较准确的反应细胞状态。

由于分子生物学的发展，现在已经诞生了mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系，用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致PH下降，GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。

优点：mRFP-EGFP-LC3稳转细胞株可以稳定持续的表达mRFP-EGFP-LC3，能够有效地解决瞬转实验的效率低、周期长、操作繁琐、不稳定等问题，有利于保证实验结果稳定性与可重复性。mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系的出现，把自噬研究带入了一个新的阶段，自噬不再只是指标，而是一种机制，自噬流的顺畅与否，对于细胞生理功能的稳定非常关键。

培养条件：

置于37℃、5％CO2培养箱中，用含10％胎牛血清（FBS; GIBCO）和1％双抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml链霉素，GIBCO）的高糖DMEM培养基培养，培养三天（密度大概80%）按照1：3的比例传代。

维持压力：puro 500ng/ml

亮点比例计算：image j软件

上海科远迪生物科技有限公司成立于2007年，致力于活体生物发光、荧光成像技术和医学冻存技术在中国的推广和应用！目前在南京、杭州等地有10多家代理商。人民卫生出版社2010年出版的《高等学校创新教材-医学实验技术系列》之《组织学与胚胎学实验技术》分册首次将活体动物体内功能成像技术（该书第十一章）写进医学院校教材，标志着该技术在国内的普及应用又上新台阶！本公司创始人参与了第十一章 《活体动物体内功能成像技术》的编写工作！本公司与交通大学第六人民医院合作完成的 《活体生物发光成像技术及其在消化道研究领域中的应用》一文发表在《胃肠病学和肝病学杂志》2010年第四期，本项目由上海市自然科学基金项目(No.04ZB14072) 资助。本公司与浙江大学基础医学院李继承教授，李冬梅博士合作完成的《小动物活体成像技术研究进展》一文发表在《中国生物医学工程学报》2009,28(6):916-921。? ? 我们经过长期的实验研究与反复验证，研发出一系列Livecyte?即用型细胞冻存液系列产品，能有效地提高常规细胞、原代细胞与干细胞的复苏后存活率与活力。产品质量稳定可靠、使用方便，助力科研工作者摆脱程序繁琐、操作复杂、容易污染的传统冻存方法，专注于后续实验研究。该系