【产品名称】
通用名称：猪瘟病毒/猪蓝耳病病毒通用型（CSFV/PRRSV-U）核酸检测试剂盒（双重荧光PCR法）
英文名称：Classical Swine Fever Virus and Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Detection Kit（Real-Time PCR Method）
【包装规格】50 T/盒
【产品用途】
适用于检测标本中的猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征（简称猪蓝耳病）病毒，适用于猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒感染的辅助诊断及流行病学调查。
【产品简介】
猪瘟是由猪瘟病毒（CSFV）感染猪体后引起猪高热稽留、全身广泛性出血及母猪繁殖障碍等一系列症状的疾病。猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）诱发的传染病，以母猪发热、厌食和流产、死胎，产木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征。这2种疾病是危害养猪业的重要病毒性疾病，对于早期鉴别诊断病及时了解流行状况对控制这3种疾病尤为重要。
本试剂盒分别对猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的基因保守区设计特异性引物和探针，用一步法荧光RT-PCR技术对猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
【产品内容】
组分 | 规格 |
CSFV/PRRSV-U反应液 | 1100μL×1管 |
混合酶液 | 60 μL×1管 |
CSFV/PRRSV-U阳性对照 | 100 μL×1管 |
阴性对照 | 100 μL×1管 |
【贮存及有效期】
-20 ℃避光保存与运输，反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。
【注意事项】
PCR方法具有极高的灵敏度，应用于临床检验必须采取严格的质控措施才能保证实验结果的准确性，在样本采集、核酸提取、扩增、产物分析、结果报告的整个流程都要做好质量控制。本项详细的列出了良好的动物疫病PCR检测实验室所应遵循的操作规范。
1. 病毒病料操作前必须做好个人防护，接触病料的物品应合理处置，以免污染实验室和环境。
2. 实验操作应分区域进行（试剂准备区、样本制备区、扩增区和产物分析区），每一区域都须有专用的仪器设备。各区域所用的仪器设备必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。
3. 样本处理应在样本制备区指定的生物安全柜内进行。
4. RNA提取过程要注意防止RNA降解，尽量缩短操作时间，建议使用与科前公司提供的商品化核酸提取试剂盒配套使用。
5. 实验操作过程中，操作者必须戴手套，当怀疑手套有污染时就要更换手套。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效的防止污染的措施。
6. 用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液频繁地冻融，贮存试剂应分装冰冻贮存。分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定，试剂分装应在超净台中进行。
7. 在打开含有反应液或样本的离心管前，都要完全溶解后混匀，快速离心数秒。
8. 小心的打开或关闭各样本管，避免样本喷洒或喷溅出来。
9. 使用带滤芯的一次性吸头操作，吸头不要暴露于空气中。
10. 根据所使用荧光定量PCR仪的要求选择合适的耗材，采用光学平盖的PCR管或八联管。
11. 不要把扩增产物带到反应配制区。
12. 用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器(含1%次氯酸钠溶液)内。含有PCR产物的任何废液必须收集到1 mol/l盐酸中，应到远离PCR实验室的地方弃掉。
13. 经常使用有效氯含量2 g/l的次氯酸钠清洁实验台及设备。
【样本采集】
病死或扑杀猪，取淋巴结、脾脏、胰脏、回肠、肝脏、肾脏、肺脏、扁桃体等组织；待检活猪，取口腔拭子或用注射器取血5 ml至无菌离心管或EDTA抗凝管。
【样本前处理】
组织样品：取1g组织，剪碎，加入2ml生理盐水进行研磨，制备组织匀浆，8000r/min离心5min，取上清用于后续的核酸提取。
口腔拭子样品：加入500 μL无菌PBS充分涡旋震荡1min，反复挤压拭子，弃去拭子后3000r/min离心5min，取上清用于后续的核酸提取。
抗凝血样本：无需进行前处理，直接用于核酸提取。
全血样本：室温或者37℃倾斜放置自然凝集20~30min，2000r/min~3000r/min离心10min，吸取上清液用于后续的核酸提取。
【操作步骤】
1.试剂准备：（试剂准备区）
（1）从-20 ℃以下冰箱中取出试剂盒相应试剂，完全融化混匀后，快速离心数秒。
（2）在冰上准备主反应混合液，核算当次实验所需要的反应数（n），计算当次实验所需要的各种试剂量。考虑加样误差，可多配出5-10% 的量。
n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+样本数+误差预留量
单反应体系配方 | CSFV/PRRSV-U 反应液 | 19 μL |
混合酶液 | 1 μL |
（3）在适当容积的无核酸酶离心管中加入上述试剂，混匀后快速离心数秒。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管中。
（4）将PCR反应管转移至样本准备区。
2.核酸提取：（样本准备区）
病毒RNA的提取纯化，推荐使用本公司“病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒（柱提法）”或者“核酸提取纯化试剂盒（适配机提）”。
阴性对照和阳性对照可以不经提取直接用于PCR扩增。
3.加样：（样本准备区）
每管加入样本模板5 μL，阳性对照和阴性对照也各加5 μL。先加阴性对照，再加样本，最后加阳性对照，加入后立即盖紧反应管，震荡混匀后快速离心数秒。
4. PCR扩增：（核酸扩增区）
（1）将PCR反应管放置在仪器样本槽相应位置，记录放置顺序。
（2）设置仪器运行参数，进行PCR扩增，反应体系设置为25 μL。
荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM、ROX，淬灭通道（Quencher Dye）选择NONE，ABI系列仪器请勿选择ROX参比荧光，选择None即可。
信号 采集 | FAM和ROX通道采集荧光信号 |
PCR 反应 条件 | 阶段 | 条件 | 循环数 |
反转录 | 50 ℃、10 min | 1 cycle |
预变性 | 95 ℃、2 min | 1 cycle |
扩增 | 95 ℃、10 sec | 40 cycles |
60 ℃、30 sec （此阶段结束时采集荧光信号） |
【结果判定】
1.条件设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪声情况进行调整。
2.对照标准
阳性对照：Ct值≤32并出现特征性扩增曲线，
阴性对照：无特异性扩增曲线或无Ct值；
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
3.结果描述及判定
FAM通道为猪蓝耳病病毒检测结果，ROX通道为猪瘟病毒检测结果
阳性：当被检样本出现特征性扩增曲线且Ct值≤40；
阴性：被检样本Ct值＞40或无Ct值。
【参考标准】
《核酸扩增检测用试剂（盒）（YY/T1182-2010）》
《转基因产品检测实验室技术要求（GB/T 19495.2-2004）》
【生产企业】 武汉光启生物科技有限公司
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仅供兽医诊断使用
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