5-NT 小鼠5核苷酸酶ELISA检测试剂盒

检测原理：

试剂盒预先包被小鼠5核苷酸酶（5-NT）捕获抗体的微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤后，用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，在酸的作用下最终转化为黄色，颜色深浅与样本中5-NT的含量呈正相关。

样本处理要求：

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1、血清‌：室温血液自然凝固10-20分钟，2000-3000转/分离心20分钟，收集上清，出现沉淀需再次离心。

‌2、血浆‌：选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，2000-3000转/分离心20分钟，收集上清。

‌3、组织标本‌：切割后称重，加入pH7.4的PBS缓冲液，液氮冷冻备用，融化后匀浆充分，离心取上清。

4、注意：标本采集后尽快提取，若不能立即实验可-20℃保存，避免反复冻融；不可检测含NaN₃的样本，其会抑制HRP活性。

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操作步骤：

‌一、试剂准备‌：试剂盒从冷藏环境取出后，室温平衡15-30分钟；30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释备用，若有结晶可水浴加温助溶。

‌二、标准品稀释‌：在酶标板设10个标准品孔，通过梯度稀释，最终得到浓度为180ng/L、120ng/L、60ng/L、30ng/L、15ng/L的标准体系，每孔最终加样量50μl。

‌三、加样‌：设置空白孔、标准品孔、待测样品孔。待测样品孔先加40μl样品稀释液，再加10μl待测样品，样本最终稀释度为5倍，加样时尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

‌四、温育‌：用封板膜封板后，置于37℃环境温育30分钟。

‌五、洗涤‌：揭掉封板膜，弃去液体甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复5次，拍干孔内残留液体。

‌加酶与二次温育‌：除空白孔外，每孔加入50μl酶标试剂，再次用封板膜密封，37℃温育30分钟。

‌六、二次洗涤‌：重复上述洗涤操作5次，拍干。

‌七、显色‌：每孔先加入50μl显色剂A，再加入50μl显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

‌八、终止与读数‌：每孔加入50μl终止液，此时蓝色立即转为黄色。加终止液后15分钟内，以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。