兔外周血巨噬细胞

方法简介  实验室分离的兔外周血巨噬细胞采用取外周血、通过密度梯度离心法、差速贴壁、细胞因子诱导法制备而来。

质量检测  实验室分离的兔外周血巨噬细胞经CD68免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  兔外周血巨噬细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 巨噬细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 利多卡因（12 mM）

兔外周血巨噬细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

步骤一：无菌采血与样本稀释预处理 超净工作台紫外灭菌30分钟，备好无菌采血耗材、肝素抗凝管、无菌PBS、巨噬细胞专用分离培养基。无菌采集兔外周血，抗凝处理后轻柔颠倒混匀，防止血液凝固，将抗凝血与无菌PBS按1:1比例充分稀释，去除血液粘稠度，便于后续分离操作，全程无菌低温操作保护细胞活性。

步骤二：密度梯度离心分离单个核细胞 采用淋巴细胞分离液进行密度梯度分离，将稀释血液缓慢叠加于分离液液面，保持界面平整清晰，设置2000rpm、20分钟低速离心。离心后吸取中间白膜层单个核细胞，转移至无菌离心管，为巨噬细胞诱导培养提供基础细胞样本。

步骤三：细胞洗涤除杂与重悬 向收集的单个核细胞中加入4mL无菌PBS，轻柔吹打混匀，1500rpm离心7分钟，弃去上清液，去除残留分离液、红细胞碎片与血浆杂质。重复洗涤2次，最后用巨噬细胞专用完全培养基重悬细胞沉淀，制备均匀细胞悬液。

步骤四：贴壁筛选纯化巨噬细胞 将细胞悬液接种至无菌培养皿中，置于37℃、5%CO₂培养箱静置贴壁培养4小时，利用巨噬细胞易贴壁、淋巴细胞悬浮的特性进行纯化。培养结束后吸出上层悬浮未贴壁细胞，用预热PBS轻柔洗涤培养皿2次，彻底去除残留悬浮杂细胞，获得纯化贴壁巨噬细胞。

步骤五：细胞计数与浓度调控 加入胰酶温和消化贴壁巨噬细胞，终止消化后制备单细胞悬液，台盼蓝染色计数活细胞，精准统计细胞数量。调整细胞悬液浓度至6×10⁵个/mL，适配巨噬细胞贴壁增殖、活化培养的最佳密度。

步骤六：规范接种培养定型 将纯化后的巨噬细胞悬液接种至全新无菌培养容器中，轻轻十字晃动铺匀，保证细胞均匀贴壁生长。标注细胞批次、接种时间、培养条件，做好实验记录，避免样本混淆。

步骤七：恒温诱导养护与监测 放入恒温培养箱静置培养24小时，待细胞完全贴壁伸展后更换新鲜完全培养基，后续每48小时换液一次。每日显微镜观察巨噬细胞形态、贴壁状态与活化情况，及时清除污染、死细胞，维持稳定培养环境。