兔主动脉内皮细胞

方法简介  实验室分离的兔主动脉内皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法、并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔主动脉内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 兔主动脉内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔主动脉内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

1. 细胞复苏：取出冻存兔主动脉内皮细胞冻存管，37℃水浴快速融化冻存样本，少量冰晶残留取出冻存管，75% 酒精擦拭管壁，移入生物安全柜，细胞悬液缓慢滴加到含有内皮细胞完全培养基的离心管。

2. 离心去除冻存保护剂：离心管配平，1000rpm 离心 5min，离心完成，轻柔吸弃上层冻存上清液，内皮细胞沉淀松散，切勿吸走细胞。

3. 温和重悬细胞沉淀：加入预热兔主动脉内皮细胞完全培养基，轻柔吹打管底沉淀，打散细胞团聚物，制备单细胞悬液，规避剧烈吹打造成细胞破损。

4. 计数接种铺瓶：活细胞计数，按照大血管内皮细胞推荐密度接种培养瓶，接种结束十字晃动培养瓶，细胞均匀分布瓶底。

5. 培养箱静置孵育贴壁：将培养瓶放入 37℃、5% CO₂饱和湿度细胞培养箱，静置孵育 24h，不随意挪动培养瓶，保障内皮细胞贴壁伸展。

6. 首次换液清除死细胞碎片：孵育 24h 后镜检细胞贴壁情况，弃旧培养基，去除悬浮死亡细胞，添加预热新鲜完全培养基放回培养箱。

7. 扩增培养传代应用：每 2‑3 天更换培养基，观察内皮细胞鹅卵石样形态，汇合 80‑85% 胰酶消化传代，用于血管内皮损伤、动脉相关体外实验。