小鼠肺微血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠肺微血管内皮细胞采用组织贴块法并结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肺微血管内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 小鼠肺微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠肺微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

一、实验前准备

1. 试剂：DMEM 高糖完全培养基（10% 胎牛血清 + 1% 双抗 + 内皮细胞生长添加剂 ECGS）、PBS 缓冲液、0.25% 胰蛋白酶 - EDTA、Ⅱ 型胶原酶、肝素钠溶液、75% 医用酒精。

2. 器械与耗材：超净台、CO₂培养箱、解剖剪 / 镊子、无菌培养皿、15mL 离心管、细胞筛（200 目 + 400 目）、细胞培养瓶、移液枪。

3. 动物：6~8 周龄健康 SPF 级小鼠，雌雄不限；所有器械高温高压灭菌，台面紫外消毒 30min。

二、取材与预处理

1. 小鼠颈椎脱臼处死，75% 酒精浸泡全身 5min 消毒，固定于无菌解剖板，逐层剪开胸腔暴露完整肺组织。

2. 小心剥离肺门处气管与大血管，完整摘取双肺，预冷无菌 PBS 反复漂洗 3 次，去除肺表面血迹与杂质，剪去肺边缘坏死组织。

3. 将肺组织转移至无菌培养皿，剪碎至 1mm³ 左右组织碎块，加入预冷 PBS 吹打漂洗，静置弃上清，重复 3 次去除红细胞。

三、细胞分离与消化

1. 按组织体积 1:3 加入 0.1%Ⅱ 型胶原酶消化液，37℃水浴摇床低速振荡消化 30~40min，期间每 10min 轻柔吹打一次。

2. 消化完成后加入等体积完全培养基终止酶解，先后过 200 目、400 目无菌细胞筛，滤除未消化组织团块，收集滤液至离心管。

3. 1000r/min 离心 5min，弃上清，PBS 重悬沉淀再次离心洗涤 1 次，去除胶原酶残留。

四、纯化与接种培养

1. 沉淀用内皮完全培养基重悬，接种于培养瓶，置于 37℃、5% CO₂培养箱孵育 45min，利用差速贴壁去除成纤维细胞、平滑肌杂细胞。

2. 吸出上清细胞悬液转接新培养瓶，添加肝素钠抑制平滑肌细胞增殖，常规培养；24h 后首次换液，去除悬浮死细胞。

3. 细胞汇合度达 85%~90% 时，胰酶常规消化传代；采用 CD31 免疫荧光鉴定内皮纯度，P1~P3 代用于后续实验。