小鼠海马神经元细胞

方法简介  实验室分离的小鼠海马神经元细胞采用胰蛋白酶消化法、神经元专用培养基培养筛选结合化学试剂抑制法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠海马神经元细胞经β-Tubulin-Ⅲ免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 小鼠海马神经元细胞完全培养基(含B-27 Supplement、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 神经元细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 0.125%胰蛋白酶

小鼠海马神经元细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，需快速取材以保证神经元活力

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、Neurobasal培养基、B27添加剂、NGF、BDNF、NT-3、聚赖氨酸、脑基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标脑区/脊髓/神经组织，用预冷无钙镁PBS仔细冲洗

在显微镜下仔细分离目标区域，去除血管和膜组织，剪碎至1mm3

用0.25%胰蛋白酶在37度消化15-20分钟，加入DNase I辅助消化

用含FBS的DMEM终止消化，移液器轻柔吹打制成单细胞悬液

经40um滤网过滤后，300g离心5分钟收集神经元细胞

原代培养要点

将神经元细胞接种于聚赖氨酸包被的盖玻片或培养皿中，使用Neurobasal+B27培养基

接种密度建议1-2x10^5 cells/cm2，37度、5% CO2、95%湿度培养

神经元培养需添加NGF(10ng/mL)、BDNF(10ng/mL)等神经营养因子

7-14天后可观察到明显的神经元突起生长，21天后形成神经网络

常见问题优化

神经元存活率低：培养基中添加GlutaMAX和丙酮酸钠可提高神经元存活率

胶质细胞过度生长：使用Ara-C(10uM)处理可抑制胶质细胞增殖

神经元突起生长不良：添加NGF、BDNF等神经营养因子，使用脑基质胶包被基底

无菌准备：超净台紫外灭菌 30min，神经元专用无血清培养基、PBS，37℃水浴预热；准备多聚‑L‑赖氨酸包被培养板 / 皿、离心管，包被基质保障神经元贴壁。

冻存细胞复苏：冻存管 37℃水浴快速融化，融化后酒精擦拭管壁转入超净台，细胞悬液缓慢加入神经元培养基离心管轻柔混匀，吹打力度务必轻柔，神经元极易损伤。

低速离心去除冻存液：250g 室温离心 6min，降低离心转速，减少神经元损伤；小心吸弃上清冻存保护剂。

轻柔重悬细胞：加入神经元无血清完全培养基，极轻柔吹打 3‑5 次，禁止剧烈吹打；台盼蓝计数活神经元细胞。

接种包被器皿：将细胞悬液接种至多聚‑L‑赖氨酸包被好的培养板，轻柔晃动培养板，细胞均匀分布孔底。

恒温孵育培养：放入 37℃、5% CO₂培养箱静置培养，神经元贴壁分化，尽量不全量换液，采用半量换液，避免神经元应激死亡，观察轴突突起生长。

细胞处理用于实验：原代海马神经元几乎不传代；需要处理样本时，直接固定、裂解收集，不进行胰酶消化传代，用于神经毒性、电生理、免疫荧光实验。