小鼠胚胎肝母细胞

方法简介  实验室分离的小鼠胚胎肝母细胞采用胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠胚胎肝母细胞经PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠胚胎肝母细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠胚胎肝母细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取肝脏组织约2-3g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、William E培养基/KSOM培养基、FBS、PBS、肝素

分离纯化步骤

取实验动物肝脏组织，通过门静脉灌注0.25%胰蛋白酶(37度、20分钟)

取出肝脏，剪碎后加入II型胶原酶37度振荡消化45-60分钟

消化液经70um和40um滤网过滤，100g离心5分钟收集肝细胞

采用Percoll不连续密度梯度离心(30%/60%)纯化肝细胞

原代培养要点

肝细胞：使用William E培养基+10%FBS+100nM地塞米松+10ug/mL胰岛素

肝细胞接种后4-6小时开始贴壁，24小时内形成典型多角形上皮样细胞

肝细胞培养3-7天后功能逐渐下降，建议实验在培养7天内完成

肝星状细胞：使用DMEM/F12+10%FBS培养，细胞呈成纤维细胞样生长

常见问题优化

肝细胞活力差：灌注压力控制在10-12mmHg，消化时间严格控制

肝细胞功能丧失：培养基中添加HGF(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可维持肝细胞功能

肝星状细胞活化：传代后细胞逐渐活化，建议冻存早期细胞

复苏准备：胚胎肝母细胞专用完全培养基、无菌 PBS、0.25% 胰酶‑EDTA 消化液置于 37℃水浴回温，超净台紫外消毒 30min，准备 T25 培养瓶、15mL 离心管、全套无菌移液耗材，检查冻存管完好无开裂漏液。

冻存管水浴解冻：液氮取出冻存管，迅速放入 37℃水浴，持续轻晃冻存管 1‑2min，大部分冰晶融化，残留少量冰屑即可取出，75% 酒精擦拭管壁，移入超净工作台。

稀释离心去除 DMSO：无菌打开冻存管，细胞悬液缓慢滴加到含有 4mL 预热完全培养基的离心管，轻柔吹打混匀，1000r/min 离心 5min，沉降细胞，去除冻存保护剂上清。

重悬铺瓶接种：离心结束弃上清，加入 2mL 胚胎肝母细胞完全培养基，轻柔吹打重悬细胞沉淀，打散细胞团块，悬液转移至 T25 培养瓶，补加培养基，多角度轻晃培养瓶，细胞均匀铺板。

恒温孵育贴壁：培养瓶平稳放置于 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，静置孵育 24h，尽量不移动培养瓶，肝母细胞贴壁速度较慢，避免晃动干扰贴壁。

换液镜检：24h 后取出培养瓶，吸弃旧培养基，PBS 轻柔漂洗细胞层，清除悬浮死细胞碎片，更换预热新鲜完全培养基，放回培养箱，每日镜检上皮样细胞形态，排查微生物污染。

传代操作：细胞汇合度 75‑80%，弃培养基，PBS 清洗细胞 2 次，加入胰酶消化液 37℃消化 2‑4min，镜下细胞收缩变圆，加入完全培养基终止消化，吹打收集细胞，离心，按适宜比例分瓶传代。